家蚕凋亡相关基因bmicad的表达及其功能研究

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1、浙江理工大学硕士学位论文摘要ICAD(DFp钙)基因在细胞凋亡过程具有重要的作用。在脊椎动物细胞中，DFF(DNAfragmentationfactor)引起DNA的断裂是细胞凋亡中的关键步骤，DFF由蛋白复合体ICAD／DFF-45和CAD／DFF一40组成。ICAD不仅可以抑制CAD的DNase活性，还具有分子伴侣作用。当细胞凋亡信号激活，效应酶Caspase3被激活开始裂解ICAD，释放CAD进入细胞核从而引起DNA裂解和核浓缩。为了研究ICAD在家蚕细胞凋亡过程中的作用，本研究通过提取家蚕五龄幼虫组织的总RNA，利用RT．PCR的方

2、法获得了BmlCAD基因的cDNA序列，该eDNA序列全长844bp，含有一个522bp的ORF，编码174个氨基酸残基，预测分子量为19．6kD，等电点为4．23。将BmlCAD基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)相应的酶切位点中，得到重组质粒pET-28a(+)．BmlCAD，经PCR、酶切鉴定以及测序分析证实重组质粒正确。将该重组质粒转化E．coliBL21(DE3)，经IPTG低温诱导(25℃)表达后，裂解茵体作SDS．PAGE分析，与阴性对照相比在25kD(融合标签为3．84kD)附近有一条特异性蛋白条带，与预测值相

3、符。重组蛋白主要以上清溶解的形式存在，利用亲和层析的方法纯化重组融合蛋白。将纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体，ELISA检测该抗体血清的效价可达到1：25600以上。亚细胞定位结果表明BmlCAD在家蚕培养细胞Bin5中主要分布在细胞质中。RNAi、MTT检测和DNA片段化检测结果表明BmlCAD基因被干扰后会显著增加BmN细胞的凋亡比例。蛋白互作研究结果表明Bm／CAD与两个蛋白因子——家蚕的DNA超螺旋因子(DNAsupercoilingfactor，SCF)和家蚕的富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secretedproteinac

4、idicandrichincysteine，SPARC)相互作用。以上的研究结果表明，BmICAD具有抑制细胞凋亡的作用，SCF和SPARC两个蛋白因子可能通过与BmlCAD的相互作用分别在DNA断裂和细胞凋亡这一过程中起重要作用。关键词：家蚕；BIIlICAD；亚细胞定位；RN础；蛋白互作浙江理工大学硕士学位论文ExrandFunctionalAnalysisofBmlCADGenexoressionandUnctionnalyslsBmlCAGene0IRelatedtoApoptosisinSilkworm，BombyxmoriAbs

5、tractTheICAD(DFF-45)geneplaysallimportantroleintheprocessofapoptosis(programmedcelldeath)．CleavageofchromosomalDNAintonucleosomalmulfimerfragmentsisahallmarkofapoptosis，whichismediatedbytheDNAfragmentationfactor(DFF)complex．DFFisaheterodimericproteincomplexconsistingofa45k

6、D(DFF45／ICAD)anda40kD(DFF40／CPAN／CAD)subunit．ICAD／DFF45actsasaninhibitorforDFF40enzymaticactivityandchaperoneforCAD／DFF一40duringitssynthesis．ICADisacaspase一3substratethatmustbecleavedtobeinactivatedandallowCAD／DFF40toexecutenuclearintemucleosomalDNAfragmentation．BmlCADgene

7、WasobtainedfromthefifthinstarlarvaofBombyxmoribyRT—PCtLTheBmlCADeDNAWas844bpinlength，containinga522bpopenreadingframe(ORF)，whichencodedaproteinof174aminoacids；themolecularweightofthisproteinWasestimatedtobe19．6kDandtheisoelectricpointWas4．23．ThegenewasclonedintothepET-28a(

8、+)vector,andoverexpressedinE．coliBL21(DE3)asHis-taggedfusionproteins，inducedbyIPTGat25"C．