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时间:2019-02-02
《家蚕转胶蛋白基因的原核表达及功能的初步研究》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、浙江理I:人学硕+学位论文摘要转胶蛋I刍(transgelin)作为一种肌动蛋白结合蛋白,在成体脊椎动物的平滑肌组织中含量丰富。转胶蛋白的表达是平滑肌细胞(smoothmusclecells,SMC)早期分化的标志。目前,国内外对转胶蛋白的研究多数集中在脊椎动物上,而对无脊椎动物的研究较少。本研究从NCBI核酸数据库中搜索到家蚕转胶蛋白(BmTGN)的cDNA序列。该基因ORF长为567bp,编码188个氨基酸残基,预测分子量为20.89kD。同源性比较表明该基因编码的氨基酸序列与蜜蜂同源性为86.7%。将BmTGN基因的ORF克隆到表达载体pET-28
2、a(+)_(N应的酶切位点上,得到重组质粒pET-28a(+).BmTGN。将该重组子转化E.coliRosetta。经IPTG诱导表达后,裂解菌体作SDS.PAGE分析,与阴性对照相比在25kD左右的位置有一条特异性蛋白条带。以亲和层析的方法纯化上清液,获得目的蛋白His.BmTGN。目的蛋白经FPLC反相柱层析进一步纯化后,进行质谱分析,结果显示该融合蛋白的分子量为24.589kD,与理论值24.45kD相符,从而证实了该蛋白表达的正确性。将纯化的融合蛋白免疫新西兰兔获得多克隆抗体,ELISA检测该抗体血清的效价可达1:6400以上。利用实时荧光定量
3、PCR的方法,对BmTGN在家蚕不同发育时期、不同组织中的mRNA的量进行比较,并采用Westernblotting方法对BmTGN蛋白的表达进行分析。结果表明,该蛋白在蚕蛹中表达量最低,而在蛾中含量最高。在五龄幼虫的中肠、表皮、丝腺、脂肪体、精巢、马氏管、卵巢、气管、头部等9个组织中均有不同程度的表达,而在中肠中的表达量最高。通过亚细胞定位发现该蛋白主要存在于细胞质中。本研究为进一步探讨BmTGN基因在家蚕中的生物学功能打下了良好的基础。关键词:家蚕;转胶蛋白;组织定位;亚细胞定位浙江理1i人!学硕十学位论文AbstractTransgelinisau
4、biquitousproteinamongsmoothmuscletissuesofnormaladultvertebrates.Transgelinexpressionisoneofthefirstmarkersofsmoothmuscledifferentiationduringembryogenesis.Mostresearchesoftransgelinarefocusedonrathervertebratethaninvertebratetodate.WeobtainedacDNAsequenceoftransgelininBombyxmori
5、fromNCBIproteinlibraryandnamedBmTGN(Bombyxmoritransgelin).Concurrentlybioinformaticmethodswereappliedtoanalyzetheobtainedsequenceanditsinducedaminoacidsequence,includingopenreadingframe(OR_V),homologoussequencesandSOon.TheOR/:ofBmTGNgenewas567basepairsthatcouldencode188aminoacids
6、withapredictedmolecularweightof20.89kD.Additionally,thesequenceoftheaminoacidsencodedbythisgenewasmoreconservativeininvertebratesthroughthehomologycomparision.UsingpET-28a(+)astheexpressionvector,andconstructedtheprocaryoticexpressionplasmidpET-28a(+)-BmTGNwhichWasidentifiedbyPCI
7、Ldoubledigestionandsequencing.TherecombinantplasmidWastransformedintoE.coliRosetta.AfterinducingwithIPTG,theanalysisofSDS—PAGEshowedthattherecombinantproteinwasexpressedinabout25kDlocation.TherecombinantproteinWassolubleandWaspurifiedwithgelfiltrationchromatographyandmetal—chelat
8、ingaffinitychromatography.Themolecularwe
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