家蚕新基因bmx的表达与亚细胞定位的研究

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1、浙江理工大学硕士论文摘要在对家蚕蛹eDNA文库测序中，筛选到一个家蚕未知功能基因BIn-X,通过对其eDNA序列生物信息学分析。该eDNA序列全长为778bp，开放阅读框(ORF)长444bp，其编码的蛋白质Bm-X，全长147个氨基酸残基，预测相对分子量为16．4kI)a，等电点为3．69，为无信号肽的非分泌的酸性蛋白。经PCR扩增得到Bm-X基因片段，经BamHI和XhoI双酶切后，插入相应酶切后质粒pET-28a(+)，构建重组融合蛋白表达载体pET-28a(+)坦m出经PCR、酶切鉴定重组正确。将构建的重组质粒转化大肠杆菌Rosseta(DE3)菌

2、株感受态细胞，筛选重组菌株后以IPTG诱导表达，裂解菌体作SDS-PAGE分析，在20．1kD处有一浓集的特异性蛋白条带，表达量可达菌体总蛋白的50％左右。融合蛋白以可溶形式存在，超声波裂解菌体后离心收集上清液，采用镍离子亲和层析柱纯化重组融合蛋白rBm-X。以该融合蛋白为抗原免疫雄性新西兰兔制备了多克隆抗体，ELISA检测该抗体血清的效价可达到1：8000以上。Westernblotting检测表明制备的多克隆血清具有较高的特异性。随后以多克隆抗体为工具，对Bm-X基因进行亚细胞定位，并分析Bm-X基因在五龄家蚕各组织蛋自和蛹中的表达分布：Bm．X在家蚕

3、BmN细胞的细胞质和细胞核中都存在，但是以细胞质中居多。Bm-X基因的表达信号主要分布于五龄家蚕中肠、头部、表皮与脂肪体，在蛹中的信号则相对偏低。关键词家蚕；新基因；功能基因：表达；细胞定位4浙江理工大学硕士论文AbstractAccordingtothelarge-scalesequencingofeDNAlibraryfromsilkwormpupae，theeDNAofanovelgenewinlblankresearchbackgroundwasidentifiedandtemporarynamedBm-X．ThelengthofthiscDNAi

4、s778bp．Throughbioinformaticsanalysis,wechooseit'sOFFforfurtherstudy．Ithas444．bpandencodes147aminoacidresidues，withthepredictedmassof16．4kDaandpIof3．69．Bm-Xispredictedtobeanon-classicalsecretoryproteinwithriosignalpeptide．ThePCRproductofBm-Xwaspurified，andafterbeingdigestedwithBamH

5、IandXhoI'theDNAfragmentWasinsertedintothefusionexpressionvectorpET-28a(+)．TherecombinantplasmidwastransformedintoE．coliRosseta(DE3)．PCRanddigestionwithBamH11XhoIshowedthatthetargetfragmentwasinsertedcorrectly．RecombinantproteinwasexpressedsuccessfullyinE．coliRosseta(DE3)inducedbyI

6、PTGTheanalysisofSDS—PAGEshowedthatthefusionproteinrBm—XwasexpressedhighlyinRossetafDE3)withsolubleform．ByNi·affinitychromatography,rBm-XWaSpurified．Immunizationofrabbitwithrecombinantproteingeneratedhightiter(1：8000)polyclonalantibodies，measuringbyELISA．Westernblottinganalysisshow

7、edthattheantibodycouldbindrBm—Xspecifically,andthen,subcellularlocation,expressionanddistributionanalysisWasperformed．ItlaidagoodfoundationoffurtherstudiesofthisnovelgeneBm-X．KeyWord：Bombyxmori,novelgene，functionalgene，subcellularlocation5浙江理工大学硕士论文APBm-XBm．XBSAEDTAELISAHRPIPTGKan

8、MCSNCBIORFOPDPCRrBm．XSDS—PAGEPCRP