弓形虫烯醇化酶2基因的克隆与表达

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1、本科毕业论文题目弓形虫烯醇化酶2基因的克隆与表达学院生命科学技术学院专业生物技术（动物方向）毕业届别2014届姓名谢国华指导教师刘霞副教授张德林研究员甘肃农业大学教务处制二〇一四年五月目录摘要1关键词1Abstract.1Keywords2前言21实验材料21.1目的基因、质粒及菌株21.2主要实验试剂32方法32.1目的基因ENO2的扩增32.2琼脂糖凝胶电泳鉴定42.3克隆载体的构建42.4重组质粒的鉴定62.5重组质粒的诱导表达72.6表达产物的SDS－PAGE电泳检测73结果73.1ENO2基因的RT-PCR扩增73.2pMD-ENO2重组质粒的酶切鉴定83.3pET-ENO2重组质

2、粒的鉴定93.4ENO2基因表达产物SDS-PAGE分析…………………………………………………..94讨论10参考文献（Reference）:11致谢12谢国华：弓形虫烯醇化酶2基因的克隆与表达弓形虫烯醇化酶2基因的克隆与表达谢国华(1.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州；)摘要:弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫，呈世界性分布，可感染包括人类在内的所有脊椎动物。弓形虫严重威胁人类的生命健康，危害公共卫生，对畜牧业的发展造成巨大损失。烯醇化酶(ENO1,ENO2)为虫体不同时期的同工酶，具典型的期特异性，ENO2主要出现于速殖子时期。ENO2特异性定位在胞核中。本研究针对弓形虫ENO基因序列

3、设计引物，采用RT-PCR技术从弓形虫GJS株的cDNA中扩增ENO2基因片段，构建重组质粒pMD-ENO2。测序结果表明，获得的基因序列与NCBI已公布的序列相似性为100%。将ENO2基因定向亚克隆至原核表达载体pET-30a（+）中，并转化至大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导表达。经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表明，ENO2基因在大肠杆菌中成功表达，以包涵体的形式为主，分子量大小约为1335bp。本研究为下一步研制基于排泄分泌抗原的抗弓形虫重组疫苗奠定基础。关键词：弓形虫；烯醇酶2；克隆；原核表达Abstract:Toxoplasmagondiiisanobligateintracellul

4、arparasite,ithasaworldwidedistribution,andcaninfectallvertebrates,includinghumans.T.gondiihasseriousthreattohumanlifeandpublichealth,anditcauseshugelossestothedevelopmentofanimalhusbandry.Enolase(ENO1,ENO2)isanisozymewhichisexistsindifferentperiodsofT.gondii,andithastypicalspecificityindifferentper

5、iods.ENO2ismainlyappearedinthetachyzoite.WedesignedprimersaccordingtoENO2genesequencesofT.gondii,andENO2genewasamplifiedbyRT-PCRfromthecDNAofT.gondiiGJSstraintoconstructarecombinantplasmidpMD-ENO2.SequencingresultsshowedthatthegenesequenceandNCBIpublishedsequencesimilaritywas100%.ENO2genewassubclon

6、edandlinkedtoprokaryoticexpressionplasmidpET-30a(+),transformedintoE.coliBL21,andexpressedbyIPTGinduction.PolyacrylamidegelelectrophoresisidentificationshowedthattheENO2geneexpressedsuccessfullyinE.coli,whichgaveprioritytotheformofinclusionbody,andthesizeisabout1335bpmolecularweight.Thisstudylayafo

7、undationforfurtherdevelopmentofanti-T.gondiirecombinantvaccines,whicharebasedonthesecretedantigen.Keywords:Toxoplasmagondii;ENO2;clone;prokaryoticexpression前言13谢国华：弓形虫烯醇化酶2基因的克隆与表达弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种专性