弓形虫sag2基因的克隆、表达及其初步鉴定

《弓形虫sag2基因的克隆、表达及其初步鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、扬州大学硕士学位论文弓形虫SAG2基因的克隆、表达及其初步鉴定姓名：陶勇申请学位级别：硕士专业：中药学指导教师：刘墨祥;严华20100501陶勇：弓形虫SAG2基因的克隆、表达及其初步鉴定弓形虫SAG2基因的克隆、表达及其初步鉴定研究生：陶勇导师：刘墨祥教授严华副教授摘要弓形虫病是由刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)引起的一种重要人兽共患寄生虫病。当孕妇感染弓形虫后，容易引起早产、流产、胎儿畸形等。因此孕妇弓形虫感染的产前诊断，在优生学上意义重大。弓形虫病诊断方法大致可分为病原学检查、免疫学方法、分子生物学技术三大类。传统的病原学检查

2、方法费时、费力，且其特异性和敏感性不高，不能适应当前弓形虫病珍断及防治的需要；分子生物学诊断技术虽然具有较高的敏感性，但由于其操作复杂或实验条件要求较高，难以推广应用；免疫学诊断方法是弓形虫感染的实验诊断的常规方法，具有敏感性高、特异性强、操作简便等优点，所以，免疫学方法仍是目前弓形虫感染的主要诊断手段。由于目前常用全虫抗原作血清学检测，其结果有时会出现假阳性，给诊断带来许多不便。本实验利用基因重组技术，研制出重组抗原，以取代全虫抗原，大大提高弓形虫感染实验室诊断的精确度和敏感度。本文根据GenBank中已公布的弓形虫SAG2的基因序列用软件自行

3、设计一对引物，用此引物对目的基因片段进行RT-PCR扩增，用PCR纯化试剂盒对PCR产物进行纯化。利用质粒提取试剂盒在大肠杆菌的DH5Q中提取PGEX一4T～1质粒。然后对纯化的PCR产物与pGEX-4T-1质粒用限制性内切酶屁胡I和国-I双酶切，利用琼脂糖凝胶回收PCR酶切产物和质粒的酶切产物。用大连宝生的连接试剂对PCR和pGEX一4T—l的回收产物进行连接，构建pGEX一4T～1／SAG2重组质粒。用PCR结合双酶切的方法鉴定，核酸测序验证。将pGEX-4T-1／SAG2重组质粒转化表达宿主大肠杆菌BLz。(DE。)，然后用异丙基硫代半乳糖

4、苷(IPTG)进行诱导表达。表达产物经SDS—PAGE电泳检测验证后，将重组菌表达产物溶于尿素中，通过精氨酸氧化／还原2扬州大学硕士学位论文型谷胱苷肽系统进行复性。复性后的蛋白再进行超滤浓缩，将浓缩后的蛋白溶液过GST亲和层析柱。并用酶标技术(ELISA间接法)和金标技术(捕获法、双抗原夹心法)对纯化的GST-SAG2融合蛋白的抗原性进行鉴定，最终获得保留天然蛋白抗原性和特异性的重组蛋白。以此作抗原，检测人血清弓形虫抗体，证明具有高度的敏感性和特异性。关健词：弓形虫：GST—SAG2(GST—P22)；克隆；表达：蛋白纯化：ELISA陶勇：弓形虫

5、SAG2基因的克隆、表达及其初步鉴定AbstractM．S．Candidate：YongTaoSupervisor：Prof．MoxiangLiu；ViceProf．HuayanToxoplasmadiseasescausedbyToxoplasmagondiiisakindofdiseasesthatbotllhumanbeingsandanimalssufferredfrom．Itcouldcauseprematuredelivery,miscarriage，fetalmalformationwhenpregnantwomenwereinfe

6、ctedbyToxoplasmagondii．TheprenataldiagnosisofpregnantwomeninfectedbyToxplasmaisofgreatsignificancetoeugenics．DiagnosismethodsofToxoplasmadiseasescanberoughlydividedintotreemajorcategories：pathogenicexamination，immunologicalmethods，molecularbiologytechnology．Thetraditionalmeth

7、odofpathogenicexaminationistime-consuming，laborious，anditsspecificityandsensitivityisnothigh，can'tadapttOthecurrentdiagnosisofToxoplasmadiseasesandtheneedforpreventionandtreatment．Althoughmoleculardiagnostictechniqueswithhighsensitivityandspecificity,butbecauseofitscomplicate

8、doperationorhigherexperimentalconditionsneeded，itisdifficulttopromot