弓形虫rack1基因的克隆、表达与特性分析

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1、中山大学硕士学位论文弓形虫R,^CKI基因的克隆、表达及特性分析弓形虫RACKl基因的克隆、表达及特性分析专业：病原生物学硕士生：侯俊然导师：何蔼副教授摘要研究背景及意义弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种专性细胞内寄生原虫，可寄生在除红细胞外的几乎所有有核细胞中，引起严重危害人类及家畜的弓形虫病。弓形虫病呈世界性分布，各地感染率不一，对于不同的人群，弓形虫感染的结果也不同。对于一般人群，常引起无症状的隐性感染；对于免疫力低下的特殊人群则可引起严重后果，甚至死亡；妊娠期妇女感染，则可引起流产、畸胎、死胎等不良

2、后果。另外，弓形虫也是造成畜牧业经济损失的一个重要原因。调查结果显示，各地弓形虫的感染率呈上升趋势，严重危害公共卫生健康。但是，目前对于弓形虫病的治疗以及疫苗的保护性效果都不尽人意。只有在充分了解了弓形虫的入侵、致病分子机制以及免疫应答分子机制，才可研制出具有针对性的高效、低毒的抗弓形虫药物和高保护性效果的核酸疫苗。蛋白激酶c受体l(receptorforactivatedCkinase1，RACKl)为一分子量约为36KD的支架蛋白，属于WD40家族。研究证明，在蛋白激酶C(proteinkinasesC，PKC)细胞

3、信号转导通路中，它不仅可以结合稳定PKC，而且可以和其他蛋白结合调节细胞的生理效应。在疟原虫中，研究证明RACKl可能参与其无性生活史阶段，参与其红细胞内期状态的形成。在杜什利什曼原虫中，RACKl具有强免疫保护性，是理想的基因疫苗候选分子。在弓形虫的入侵机制研究中，PKC转导通路具有下调巨噬细胞功能，增加弓形虫自身的易感性等重要功能。研究弓形虫的RACKl蛋白对于研究弓形虫的入侵和致病机制具有一定意义。研究目的构建重组质粒PET-30一RACKl大肠杆菌表达体系，实现目的蛋白的体外表达：用纯化的目的蛋白与PKC进行结合

4、实验，为研究PKC细胞信号转导通路在弓形虫入侵、致病机制中的作用提供分子基础；检测其免疫原性和免疫中山大学硕士学位论文弓形虫RACKI基因的克隆、表达及特性分析保护性，为研制弓形虫基因疫苗提供候选分子；通过生物信息学分析，绘制关于RACKl的进化树，了解其作为功能进化基因的价值。研究方法1弓形虫RACKl基因克隆菌株pMD一18-RACKl／JMl09的构建和序列测定提取弓形虫总RNA，逆转录为cDNA：以CDNA为模板PCR扩增目的基因，构建克隆菌株PMD．18．RACKl／JMl09，序列测定、对比分析。2生物信息学

5、分析目的蛋白基因序列利用生物信息学软件，输入目的基因序列，预测目的基因的结构及表达蛋白的结构和功能。3弓形虫RACKl基因表达菌株PET．30RACKl／BL21的构建及重组蛋白的表达将重组质粒pMD一18一RACKl和表达质粒PET-30均进行双酶切、连接、转化、构建表达菌株。IPTG体外诱导表达，SDS—PAGE和Westemblot鉴定。4目的蛋白的纯化和结合分析利用HIS标签结合柱纯化目的蛋白，用纯化的目的蛋白做结合功能分析。研究结果l构建RACKl基因克隆菌株并进行序列测定提取的总RNA28S、18S、5S三条

6、带清晰完整，OD260／0D280=2．04。PCR扩增出大小约1000bp的目的条带。测序结果比对，同源性为100％。2生物信息学分析RACKl基因理论分子量为35147．32da、等电点为5．87、消光系数为76620。RACKl蛋白含有七个WD40保守结构域，具有疏水性，在第234--254位氨基酸处有跨膜螺旋结构，具有富含苏氨酸、甘氨酸、半胱氨酸的结构域，和疟原虫在同一进化水平，所在的进化支比人类所在的进化支长。3构建表达载体并实现了目的蛋白的体外表达SDS．PAGE分析显示目的条带大小约为36KD，与理论值相符

7、。Westemblot分析目的蛋白可以被抗HIS抗体识别。4目的蛋白经HIS标签结合柱纯化，经鉴定为目的蛋白，Westemblot分析目的蛋白可以被兔抗弓形虫血清，人抗弓形虫血清识别。目的蛋白与PKC结合，经Westemblot分析，可被人抗PKC抗体识别。结论1构建了弓形虫RACKl基因的克隆工程菌株，为目的基因的表达奠定了基础。2生物信息学分析目的基因具有抗原性和与蛋白结合的功能，为基因的进一步研究提供理论基础；在进化方面，具有功能进化基因的价值，人与鼠处于同一进化水平，则用鼠作为弓形虫的感染模型，对弓形虫病的研究具

8、有一定意义。3成功构建了弓形虫RACKl基因的表达工程菌株，得到重组融合蛋白。4重II中山大学硕士学位论文弓形虫RACKl基因的克隆、表达及特性分析组融合蛋白具有抗原性，并可和PKC结合，黏附和致病的分子机制提供分子基础关键词：弓形虫；RACKI；克隆；表达；III具有结合活性，为进一步研究弓形虫结合中山大学硕士学位