球毛壳菌glu基因克隆、表达与表达产物特性的分析

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1、国内图书分类号：Q78学校代码：10213 国际图书分类号：577密级：公开理学硕士学位论文球毛壳菌glu基因克隆、表达及表达产物特性研究硕士研究生：陈刚导师：杨谦教授申请学位：理学硕士学科：生物化学与分子生物学所在单位：理学院答辩日期：2010年6月授予学位单位：哈尔滨工业大学ClassifiedIndex:Q78 U.D.C:577DissertationfortheMaster’sDegreeinScienceGLUGENEFROMCHAETOMIUMGLOBOSUM:CLONING,EXPRESSIONANDCHARACTERIZATIONCandidat

2、e：ChenGangSupervisor：Prof.YangQian AcademicDegreeAppliedfor：MasterofScienceSpeciality：BiochemistryandMolecularBiologyAffiliation：SchoolofScienceDateofDefence：June,2010Degree-Conferring-Institution：HarbinInstituteofTechnology哈尔滨工业大学理学硕士学位论文摘要在农业生产上，植物病害的防治一直是一个重要的环节，尤其是对于由真菌引起的病害。多数病害的

3、防治主要依赖于化学农药的使用，但该使用易对环境造成污染，危害人类牲畜的健康。所以，人们应该考虑应用生物防治方法来控制植物病害。其中球毛壳菌（Chaetomiumglobosum）是目前研究用于生物防治的有益真菌，它产生细胞壁水解酶如β-1，3-葡聚糖酶，细胞壁水解酶破坏植物病原真菌细胞壁，杀死植物病原真菌。因此，球毛壳菌（C.globosum）是生物防治分子机理研究和优良生物防治基因克隆的理想生物材料。为了利用重组β-1，3-葡聚糖酶生产生物农药，根据毕赤酵母（Pichiapastoris）容易培养、外源蛋白表达量高等特点，本研究采用GS115毕赤酵母分泌表达系统

4、作为表达工具。首先利用生物信息学手段，即BLASTX相似性搜索从已构建的球毛壳菌EST库中筛选得到β-1，3-葡聚糖酶基因（glu）的5’和3’端，设计引物扩增出球毛壳菌β-1，3-葡聚糖酶基因，并提交GenBank,得到的序列号为FJ587923。然后用立枯丝核菌诱导球毛壳菌后提取球毛壳菌RNA，经反转录和PCR扩增后得到β-1，3-葡聚糖酶基因的cDNA序列。将经EcoRI和NotI双酶切的β-1，3-葡聚糖酶基因的cDNA和酵母表达载体pPIC9K进行体外连接，构建酵母重组表达载体，得到重组表达质粒pPIC9K-glu。将pPIC9K-glu和pPIC9K空

5、质粒分别用限制性内切酶BspEⅠ线性化后，电转化GS115毕赤酵母感受态细胞，转化子经甲醇利用表型筛选和PCR检测筛选得到2株低效利用甲醇的阳性转化子。对这两株阳性转化子发酵后取上清进行SDS-PAGE检测和酶活测定得到1株高效表达β-1，3-葡聚糖酶的阳性转化子。对上述得到的转化子进行酶活测定与酶学特性研究，并对重组GLU的抑菌性进行了初步研究。发现该GS115转化子在第3天出现产酶高峰，重组GLU在温度为45℃时酶活性最高。根据该发酵条件，以昆布多糖为底物测得的重组GLU发酵液上清酶活为1.31U。另外，分别以尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、核盘菌（S.

6、sclerotiorum）、立枯丝核菌（R.solani）、稻瘟病菌（P.grisea）、叶枯病菌（S.tritici），杨树烂皮病菌（V.sordida）的细胞壁作为底物，测定重组GLU粗酶液的酶活性。结果表明，重组GLU对植物病原真菌尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、立枯丝核菌（R.solani）、稻瘟病菌（P.grisea）比对核盘菌（S.sclerotiorum）、叶枯病菌（S.tritici）、杨树烂皮病菌（V.sordida）的细胞壁的酶活性要高，说明重组GLU对前三种植物病原真菌细胞壁的水解作用更明显，间接证明了重组GLU-I-哈尔滨工业大学理学

7、硕士学位论文对尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、立枯丝核菌（R.solani）、稻瘟病菌（P.grisea）具有更好的抑制作用。通过转化毕赤酵母GS115得到的重组GLU具有较高的酶活性，且对某些植物病原真菌有较明显的生物防治作用，所以该研究具有较高的理论意义和实际应用价值。关键词球毛壳菌；β-1，3-葡聚糖酶；毕赤酵母；生物防治-II-哈尔滨工业大学理学硕士学位论文AbstractInagriculturalproduction,itisalwaysimportanttocontrolplantpathogens,especiallypathogenicfu

8、ngi.A