人工合成肺孢子菌p55蛋白串联基因的克隆表达与产物分析

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1、·英文缩略语·英文缩写英文全称中文全称．心bpIPTGKDLBPAGEPBSSDS嘣SGSTPCP弱GAmpicillinBasepairIsopropylthio--13·-D--galactosideKilodaltonLuria-Bertanimedium氨苄青霉素碱基对异丙基一13一D硫代半乳糖苷(千道尔顿LB培养基Polyacrylaminegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳Phosphate—bufferedsalineSodiumdodecylsarcocinateTrihydroxymethlaminolethaneGlutatlliones-tran

2、sferasePneumosystispneumoniaTandemantigengene磷酸盐缓冲液十二烷基磺酸钠三羟甲基氨基甲烷谷胱甘肽．S．转移酶肺孢子菌肺炎串联抗原基因8中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：墓塑兰

3、日期：弘oe．矢弓口中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：歪竺兰指导教师签名：勉日期：鲨墨：!：!：·中文论述摘要·人工合成肺孢子菌p55蛋白串联基因的克隆表达及产物分析目的

4、肺孢子菌肺炎(PneumosystispneumoniaPCP)，是由肺孢子菌引起的一种机会感染性致命性肺炎。常见于AIDS、恶性肿瘤、器官移植及其他免疫功能不全的人群，随着艾滋病在世界各地的蔓延流行，器官移植的开展，免疫抑制剂的广泛应用，肺孢子菌的机会性感染将成为一个严重的公共卫生问题。因此，国内外有许多学者致力于PCP防治策略以及疫苗方面的研究，但是至今尚无理想的防治措施问世。肺孢子菌55kDa蛋白(p55)是肺孢子菌的主要抗原成分之一，能刺激宿主产生抗肺孢子菌的保护性免疫反应。但是肺孢子菌体外培养困难而致p55抗原来源受限，多个p55蛋白变异体的出现又使免疫效果受到影响，这些都对利

5、用p55抗原进行免疫防治研究十分不利。本实验是通过网络数据库结合生物软件分析的方法，分析p55蛋白可能在肺孢子菌肺炎中起重要作用并具有较好抗原性参数的区域作为候选抗原表位，从5个p55蛋白变异体中共选取了十二个B细胞表位，将各表位进行串联后形成嵌合体，人工合成串联基因后进行体外表达，为PCP疫苗的深入研究提供实验依据。方法一、抗原表位预测运用生物信息学方法对p55蛋白的二级结构，亲水性，穿膜螺旋，N．糖基化位点，氨基酸序列的亲疏水性，表面可及性，分子柔韧性及抗原性参数进行预测分析，设计抗原表位多肽。‘二、基因合成和测序鉴定设计多表位的串联基因，命名为TAG，由上海生工生物工程技术服务有限

6、公司合成及测序验证。三、TAG串联基因原核表达载体的构建及鉴定将该TAG基因克隆到GST融合蛋白表达载体pGEX．6p．1上，构建重组质粒pGEX-6p-1／TAG，受体菌为EcoliDH5a菌株。将该含有该重组质粒的菌株于37。C增菌，按照小量质粒提取试剂盒方法将过夜培养菌液提取质粒，应用限制性内切酶进行酶切，行琼脂糖凝胶电泳。四、TAG串联基因的扩增及表达将被证实的含有重组质粒pGEX-6p-1／TAG的EcoliDH5Q，在LB液体培养基中37℃增菌，IPTG诱导其表达，将菌体变性后进行8％SDS．PAGE电泳。五、WesternBIotting分析将表达目的蛋白和阳性对照GST蛋

7、白的菌液离心后进行超声破菌，收集上清后100"C变性5min，8％SDS．PAGE电泳。45V，3h冰浴，转移到PVDF膜上，5％脱脂奶粉、O．I％BSA封闭2小时，以1：500稀释浓度加入Anti．GST．Ab抗体，4。C过夜。PBST漂洗三次，加入HRP标记羊抗兔IgG，室温孵育2h，用DAB显色，30min内观察结果。六、TAG表达蛋白的初步纯化提取包涵体，1、2、4、6M尿素充分振荡、洗涤，将沉淀重悬含8M尿素的包涵体溶解缓