clp基因的克隆、表达与生化特性研究论文

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1、摘要CLP(Coactosin．1ikeprotein)是通过酵母双杂交方法，利用5’．脂氧合酶(5LO)作为探针，从人肺cDNA文库中发现的一个新的人类蛋白。CLP的mRNA广泛地分布在多种组织中，在胎盘、肺、肾脏以及外周血淋巴白细胞中大量表达；而内源性CLP则主要定位于骨髓细胞胞质中间。CLP与广泛存在于真核生物中的肌动蛋白解聚合因子(At)F)家族具有较高的同源性，含有同其它肌动蛋白结合蛋白相同的特异性的LKKAET序列，并与coactosin有极高的同源性。自1996年，人们从生物化学和结构生物学等角度对CLP展开了

2、系列研究，发现CLP能上调5．脂氧合酶的活性，并通过不同结合位点分别与5．脂氧合酶和肌动蛋白相互作用，参与细胞骨架运动，对白细胞的趋化、粘附和吞噬作用等炎症反应进行调控。此外，CLP也可诱发肿瘤特异性体液和细胞免疫反应。目前，人们对CLP与5LO和F．actin的结合定位，对静止和激活细胞进行调控的机制以及CLP参与肿瘤、哮喘等炎症性、免疫性疾病的发生和发展的分子机制仍需进行进一步的研究。本研究从人的肝脏cDNA文库中经PCR扩增得到CLP基因，采用原核表达系统，对人源CLP蛋白进行高效表达，经亲和层析和凝胶排阻层析纯化得到

3、高纯度的CLP蛋白，并在此基础上进行SDS．PAGE、动态光散射和分析型超速离心等实验对CLP生化特性进行分析。实验结果表明：CLP在大肠杆菌中获得高效、可溶性表达，经多种纯化方法获得高纯度的蛋白质；动态光散射实验显示：CLP蛋白质在溶液中较为稳定，主要以单体形式存在；分析超速离心分析结果显示其摩擦系数为1．909，证实了CLP蛋白质具有线性化趋势存在的可能性，且线性化程度较高。该实验结果为我们进一步搭建CLP和F．actin的作用模型提供了一定依据。关键词：人源CLP；表达；纯化；生化特性AbstractUsing5LOa

4、stheprobe，CLP(coactosin—likeprotein)，anewhumanprotein，isobtainedfromhumanlungeDNAlibrary,byyeasttwo-hybridanalysis．强cmRNAofCLPisdiscoveredinvarioustissuesandishighlyexpressedinplacenta，lung，kidneyandperipheralbloodlymphousleucocyte．EndogenousCLPmainlylocatesincytop

5、lasmofl'nalTOWcells．CLPshareshighhomologywithactin—depolymerizingfactor／cofilin(ADF)familywhichiswidelydistributedineukaryotes．ItcontainsLKKAETsequencefragmentwhichisspecificamongotheractinbindingproteins，andsharesextremelyhighhomologywithcoactosin．Since1996，Bioche

6、micalandstructuralanalysisonCLPhavebeencardedout．Sofar,ithasbeenknownthatCLPupregulatestheactivityof5LO，interactswith5LOandactinviadifferentbindingsites．Itparticipatesincytoskeletonmovements，regulatestheinflammatoryresponsesuchasthechemotaxis，adhesionandphagocytosi

7、sofleucocytes，andinducestumorspecificcellularandhumoralimmuneresponse．But，therearestillsomeunsolvedpuzzlesaboutthisprotein．Forexample，littleisknownabouttheinteractionmechanismbetweenCLP,5LOandF-action，howCLPregulatesthemovementofcells，andbywhatmolecularmechanismCLP

8、participatesintheoccurrenceanddevelopmentofsomeinflammatoryandimmunediseasessuchastumorandasthma．TllegeneofCLPWasPCRamplifiedfromhuman1ivereDNAli