弓形虫sag2基因测序、检测及表达

《弓形虫sag2基因测序、检测及表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、湖南农业大学硕士学位论文弓形虫SAG2基因的测序、检测及表达姓名：陈志强申请学位级别：硕士专业：基础兽医指导教师：程天印;王权20070501弓形虫SAG2基因的测序、检测及表达摘要弓形虫是一种专性细胞内寄生的原虫，引起人兽共患的弓形虫病，可以通过肉食品感染人及动物。建立灵敏的，快速的、PCR检测方法是必须的。本实验进行了三方面的研究。1建立猪弓形虫Nested—PCR检测方法，弓形虫基因组SAG2基因片断设计并合成两对引物，建立快速、准确、灵敏的Nested—MR检测猪弓形虫的方法。灵敏度试验结果可检测到每

2、克肉102个弓形虫基因组DNA水平：对新孢子虫、隐孢子虫、柔嫩艾美耳球虫、猪肉孢子虫牛球虫、伊氏锥虫等种病原生物检测，结果均为阴性，表明此方法特异性强。将采自兽医院门诊及屠宰场的68份猪血清样品分别用Nested—PCR和PAPS进行平行检测。PAPS初步检N68份样品，阳性及可疑的血清样品共计17份，PCR检测出阳性样品16份。结论认为，巢式PCR方法可用于弓形虫早期感染的检测，具有敏感性高、特异性强、稳定性好的特点。2弓形虫上海株DNA为模板，采用PCR方法扩增SAG2基因，通过与pGEMT-Easyve

3、ctor连接、转化JMl09、克隆、测序，得上海株弓形虫SAG2基因序列与RH株高度相似。3SAG2一pGEMT—Easyvector为模板，扩增编码主要表面抗原P22的基因片段。将该基因片段播入T／A克隆，引入酶切位点，双酶切、纯化目的片段与PGEX一6p一1按一定比例T4连接。用PCR结合双酶切的方法鉴定，核酸测序验证，将构建好的原核表达载体eP22--pGEX一6P一1转入表达菌株BL21中，用l咖ol／LIPTG诱导表达，SDS—PAGE观察表达效果，耗stern—blot对融合蛋白进行鉴定。结果：成

4、功的构建eP22一pGEX一6P_1质粒，转化宿主菌BL2l诱导4hr后能高效的表达融合蛋白。关健词：弓形虫：P22表面杭原；克隆；蛋白表达StudyonsequencingandDetectionandexpressionofSAG2geneofToxoplasmagon讲iAbstractToxoplasmagondiiwasallobligateintracellularparasite，causingToxoplasmosisinavarietyofmammalsincludinganimalsand

5、humansbymeat．Itwasnecessarytoestablishasensitive，specificPCRtechniqueforthedetectionofToxoplasmagondiiinfectioninanimal．Threeaspectshadbeendoneinthispaper．Firstly,Nested·PCRtechnologyhadbeendevelopedfordetectingToxoplasmagondiiinmeatofanimals．Twopr"mcrswere

6、designedOnSAG2sequenceofToxoplasmagondii．FragmentWasamplifiedbythisNested·PCRprocedurefromToxoplasmagondiigenomicDNAsamples，however,couldnotbeamplifiedfromgenomicDNAsamplesofryptosporidium，E．tenella,Sarcocystissuihominis．E．bovts．Trypanosomaenansi．Theresults

7、suggestedthatthismethodWasspecificforToxoplasmagondii．SensitivityofthePCRWasatl酽ToxoplasmagondiigenomicDNAleveleverygrammeat，itdemonstratedthatsensitivityoftheNested—PCRwashigher．ToxoplasmagondiicanbedetectedbythisNested-PCR．Totalof68serumsamplesoriginating

8、fromanimalhospitalandabattoirsweredetectedbyPAPSandPCR．Results：16outof68meatsampleswhichtestedbyNested—PCRwerepositiveforToxoplasmaoftoxoplasmosis，comparedto170utof68meatsamplestestedwithPAPS．Thedatain