狼毒大戟蓖麻烯合酶基因的克隆与表达分析.pdf

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1、狼毒大戟蓖麻烯合酶基因的克隆与表达分析刘洪伟2012届硕士中国林业科学研究院万方数据分类号Q781密级公开UDC学位论文狼毒大戟蓖麻烯合酶基因的克隆与表达分析CloningandAnalysisofACasbeneSynthaseGenefromEuphorbiafischerianaSteud.刘洪伟指导教师姓名邱德有研究员申请学位级别硕士专业名称生物化学与分子生物学研究方向林木分子育种论文提交日期2012年5月论文答辩日期2012年6月学位授予日期2012年7月答辩委员会主席评阅人北京·中国林业科学研究院万方数据学位论文狼毒大戟蓖麻烯合酶基因的克隆与表达分析学位论文

2、作者刘洪伟指导教师姓名邱德有研究员申请学位级别硕士专业名称生物化学与分子生物学研究方向林木分子育种论文答辩日期2012年6月中国·北京万方数据DissertationfortheDegreeCloningandAnalysisofACasbeneSynthaseGenefromEuphorbiafischerianaSteud.Candidate:LiuHong-WeiSupervisor:QiuDe-YouAcademicDegreeAppliedfor:MasterBiochemistryandMolecularSpeciality:BiologyDateofDef

3、ence:2012.6Degree-Conferring-Institution:ChineseAcademyofForestry万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得本研究生培养单位或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解中国林业科学研究院有关保留、使用学位

4、论文的规定，中国林业科学研究院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权中国林业科学研究院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签名：年月日年月日学位论文作者毕业联系方式工作单位：联系电话：电子邮件：通讯地址、邮编：万方数据摘要大戟科植物含单萜、倍半萜、二萜及三萜，这些化合物很多都具有毒性或者潜在的治疗活性。佛波酯类化合物Prostratin是一种巴豆烷(tigliane)型二萜。上世纪90年代美国国

5、立癌症研究所从大戟科植物Mamala树(HomalanthusnutansGuill.)中分离到Prostratin并被证实其具有良好的抗艾滋病病毒作用，所以近年来巴豆烷型二萜化合物生物合成途径的研究引起了广泛的关注。蓖麻烯合酶(casbenesynthase)被认为是合成巴豆烷型二萜的关键酶，人们推测通过该酶催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)环化成中间体西松烷(cembrane)，接着由西松烷变成蓖麻烯(casbene)，再通过一系列电子转移形成巴豆烷。我国科学家也从大戟科狼毒大戟(EuphorbiafischerianaSteud.)中分离到Prostratin

6、。本研究以狼毒大戟根为材料，通过RACE-PCR克隆蓖麻烯合酶，对其及另外几个物种的13个蓖麻烯合酶进行了生物信息学分析；构建原核表达载体，并在大肠杆菌中进行了表达；纯化融合蛋白，进行酶促反应，并通过气质联用检测反应产物。本论文为今后通过代谢工程技术提高Prostratin提供了一定的可能。主要研究结果如下：1.采用RACE-PCR技术从狼毒大戟根中克隆到一个蓖麻烯合酶基因，命名为EfCS(GenBank登录号:JN862821)。该基因长1969bp，编码602个氨基酸，具有典型的萜类合酶的基因结构。2.通过生物信息学方法，利用GenBank上登录14个蓖麻烯合酶基因

7、序列，分析预测了其核酸及氨基酸序列、组成成分、导肽、信号肽、跨膜结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二级结构、三级结构及功能域等。结果表明，14个CS基因对应的蛋白呈酸性。含量最高的氨基酸均为Leu。核苷酸同源性比对结果显示，CS基因主要被分成了两大类，且与导肽预测数据对应。研究还发现这些CS不存在信号肽和跨膜结构域，肽链呈亲水性。二级结构中主要结构元件为α-螺旋，包含两个萜类合成酶功能域。3.成功将蓖麻烯合酶基因亚克隆到原核表达载体pET32a中，得到含有目的基因的pET32a-EfCS原核表达重组质粒。I万方数据4.将重组质粒pET32a-