海洋低温碱性蛋白酶的基因克隆、序列分析及结构模建和功能研究

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1、中国海洋大学硕士学位论文海洋低温碱性蛋白酶的基因克隆、序列分析及结构模建和功能研究姓名：郝建华申请学位级别：硕士专业：海洋生物学指导教师：郑家声;孙谧2003.6.1塑堕坐：主里塑堂盔堂堡主迨塞：壁堂堡塑熊丝丝鱼壁塑薹里塞堕：堡型坌堑墨篓堂堕壁坠翌坐堂!Ⅱ翌海洋低温碱性蛋白酶的基因克隆、序列分析及结构模建与功能研究摘要海洋低温碱性蛋白酶(MarineLow—temperatureAlkalineProtease，MLAP)是由一海洋杆菌—QD80产的一种胞外酶。本论文主要进行了海洋低温碱性蛋白酶

2、的克隆和生物信息学分析及其空间结构的模建：利用末端半补齐技术构建了海洋杆菌QDSO的基因文库。末端半补齐技术的优点有：(1)彻底消除载体自环化的可能性；(2)消除了插入片段自身相互连接的可能性；(3)同常用的碱性磷酸酯酶法相比较，采用半补齐技术其连接产物的转化率不受影响。用酪蛋白平板法和电泳图相比较法的活性筛选方法从基因文库中筛选到一株阳性克隆(命名为pHHl)。序列测定分析表明，此重组质粒包含有长度为1377bp低温碱性蛋白酶基因的完整的开放读码框架(ORF)和上游基因调控序列。此片段编码由4

3、59个氨基酸组成的酶，计算分子量为49903．92Dal。通过构建表达载体在大肠杆菌中得到了表达。利用已有的生物信息学软件对其进行了分析。结果表明：它与铜绿假单胞菌的同源性较高，有可能是假单胞菌属。该酶含有两个结构域，分别为Zincins催化结构域和金属蛋白酶羧基端结构域。同源性分析表明此蛋白酶含有一个避“Hx出H的基元。采用不同的模建方法对海洋低温碱性蛋白酶进行了同源模建，然后对其模建结果进行了分析。结果表明用Gen03d预测方法得到的结果比用其它方法的模型更符合立体化学特性和生物学功能的规律

4、。模建的结果表明此蛋白酶含有一个狭缝，底物就在此处进行催化水解反应。同时对其低温适应性进行了预测，结果表明氢键发挥了重要作用。为了验证碱性蛋白酶的生物信息学分析结果和模建的结果，我们对其等电点、分子量、催化性基团组氨酸以及锌离子、钙离子和EDTA的影响进行了实验分析。同时对其低温适应性进行了验证。结果表明模建的结果是符合酶的功能和结构的。本结果有相当的先进性和技术创新性，填补了国内在海洋低温酶研究领域的一些空白，对加速开发我国海洋生物活性物质资源有重要的理论和实际意义。关键词．海洋低温碱性蛋白酶

5、克隆生物信息学同源模建墅蕉堡：生鱼鲞鲎盔堂塑主笙銮：查鲎堡塑堕丝曼自堕丝董里塞堕：度型坌堑墨堕塑夔堡复垫丝塑塑Cloning、sequenceanalysis、structuremodelandfunctionstudyofmarinelow—temperaturealkalineproteaseAbstractMarineLow—temperatureAlkalineProtease(MLAP)isakindofextracellularenzymefromakindofmarlnebacte

6、riumofQDS0．Thestudymainlyconcernedaboutgeneengineering、bioinformaticsandhomologymodelingofMLAP．Thegenelibrariesconstructedbythepartiallyfilledmethods．Thismethodhasseveralstrongpoints：(1)Eliminatingthepossibilityofringingselfofvector．(2)Theinsertingfr

7、agmentscan’tligateeachother．(3)Thetranslatingratewiththepartiallyfilledinmethodisequaltophosphatasemethod．Onepositiveclonewasobtainedfromthelibrarieswithcaseinflatandelectrophoresiscomparisonmethod．Analyzedthesequencingresult，thepositivecloneincludet

8、heOpenReadFrameofMLAPgeneandupperregulatorysequence．TheFragmentcodestheenzymeof459amideacids，themoleculeweightofwhichwas49903．92Dal．TheconstructedexpressionvectorexpressedinEcoli．TheMLAPwasanalyzedwithbioinformaticssoftware．Ithastwodomains：Zincinscat