戴尔根霉脂肪酶基因的克隆和表达

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1、摘要戴尔根霉脂肪酶基因的克隆与表达脂肪酶(EC3．1．1．3)是一类作用于甘油酰基的酶类。戴尔根霉脂肪酶具有良好的1，3位置专一睦，它能催化甘油三酯产生脂肪酸和单甘酯。单甘酯是一种重要的非离子型表面活性剂，已J“泛地应用于食品、乳制品和化妆品等行业。因此根霉脂肪酶常用来制备营养保健油脂和特种油脂等。但它应用的主要障碍是成本高，稳定性与活性差。构建产酶活力高的基因工程菌是当前生化研究的热点。本论文参考已报导的戴尔根霉脂肪酶基因序列设计了一对特异性引物，为了便于定向克隆，在上下游引物两端分别引入了SnaBI和NotI酶切位点。用PCR方

2、法从戴尔根霉(RhizopusdelemarAS3．230)中成功扩增出编码脂肪酶的成熟肽基因，将其连入克隆载体pUCm—T中，构建重组质粒pUCmT-LipRD，转化大肠杆菌(Ecoli)DH5a，蓝白斑初步筛选转化子，提取质粒进行SnaBI／NotI双酶切鉴定及PCR鉴定，筛选阳性克隆。序列测定结果表明，该序列与戴尔根霉的脂肪酶序列(GenBankaccessionNo．M38352)一致。重组质粒pUCmT-LipRD经测序正确后，经SnaBI／NotI双酶切与载体pPIC9K连接，构建表达载体pPIC9K—LipRD。采用电

3、击转化法，将线形化的表达载体转入受体菌组氨酸(His4)缺陷型巴斯德毕北京化工大学硕士学位论文赤酵母GSll5中，通过G418抗性平板和三丁酸甘油酯平板活性筛选法共筛选获得7株高表达的重组转化子。重组予以AOXl为启动子，用甲醇诱导表达，表达产物经SDS．PAGE电泳分析，大小为35kD，摇瓶96h发酵液酶活可达到31U／ml。考察了诱导时间、诱导剂浓度、诱导温度等条件对目标蛋白表达量的影响，结果表明，终浓度为O．9％的甲醇，诱导时间为96h，诱导温度为29℃时，表达产物的活性最大。关键词：戴尔根霉，脂肪酶基因，巴斯德毕赤酵母，基因

4、表达北京化工大学硕士学位论文analysisbySDS-PAGEandenzymeactivitymeasuredusingoliveoilassubstrates，meresultindicatedmatI①LgenewasmnctionallyexpressedinAc是妇p口s幻r括．Recombinantlipasehadam01ecularmassof35∞，showingarangesimilartothatofRDLThe1ipaseactiVityoftheculturewasupto31U／mL．Threediff

5、erentstrategies(differenttime，temperature，methllolconcentration)wereappliedtoaptimizetheinductioncondmon，theactiVityoflipasewasupto3lL∥mlundert}1eoptimalinductionconditionwhichisO．9％methnolconcentration，96h，29℃KEYWoRD：月向忍叩螂如彪朋甜，Jipasegene，P砌如p黜向，．西，geneexpressjonV北京化工大

6、学位论文原创性声明X882187本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：互磊日期：塑笪』丝关于论文使用授权的说明学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北京化工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘

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8、脂肪酶催化的一个显著特点是它不同于其他多数水解酶的催化特性，即该酶催化的水解反应是种非均相体系，水溶性的酶在底物(水不溶性)和水的界面上催化底物反应，对水镕性底物不起催化作用IIJ。人类对脂肪酶的认识和研究开始与19世纪30年代，首先