大豆蚜羧酸酯酶基因AgCarE的克隆、表达及活性分析-论文.pdf

《大豆蚜羧酸酯酶基因AgCarE的克隆、表达及活性分析-论文.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、中国农业科学2012，45(18)：3755-3763ScientiaAgficulturaSinicadoi：10．38648．issn．0578·1752．2012．18．008大豆蚜羧酸酯酶基因AgCarE的克隆、表达及活性分析杨帅，王玲，赵奎军，韩岚岚(东北农业大学农学院，哈尔滨150030)摘要：【目的】克隆大豆蚜羧酸酯酶基因，了解该酶的分子特性，为研究大豆蚜抗药性机理奠定基础。【方法】利用RT-PCR和RACE技术，克隆了1个大豆蚜羧酸酯酶基因的全长cDNA序列，命名为AgCarE,利用生物信息学软件及网上工具进行序列分析，以pET-21b为载体构建原

2、核表达系统进行表达，并以一醋酸萘酯溶液为底物进行活性测定。【结果】测序分析表明，羧酸酯酶基因AgCarE(GenBank登录号：JF970181)全长1946bp，编码526个氨基酸。羧酸酯酶AgCarE的等电点(pI)为6．08，蛋白活性中心包括3个氨基酸残基(催化三联体)：Ser186、G1u313、His434，5个N一联糖基化位点，具备羧酸酯酶的结构特征，属羧酸酯酶家族(EC：3．1．1．一)。将该基因编码序列与pET一21b载体重组，经IPTG诱导表达HIS标签融合蛋白、SDS—PAGE分析和Western-blot检测，在大肠杆菌BL21中成功表达约5

3、9kD的AgCarE蛋白，以一醋酸萘酯为底物，检测表达的羧酸酯酶活性为0．036mmol／100酶液。【结论】成功克隆、表达了大豆蚜羧酸酯酶蛋白AgCarE，以6c一醋酸萘酯为底物，检测表达的羧酸酯酶活性为0．036mmol／100pL酶液，有助于进一步了解羧酸酯酶的结构特征及水解作用，为设计研发新型杀虫剂提供可能。关键词：大豆蚜；羧酸酯酶；基因克隆；活性分析Cloning，ExpressionandActivityAnalysisofCarbOxyIeSteraSeGenefromAphisglycines(Hemiptera"Aphididae)YANGShu

4、ai，WANGLing，ZHAOKui~un，HANLan—lan(CollegeofAgriculture,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin15003Abstract：[Objective]TheobjectiveofthisstudyistoclonecarboxylesterasegeneandprovideamolecularbasisforinsecticideresistanceofAphisglycines．[Method]Afull—lengthcDNAwasclonedbyusingreversetra

5、nscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR)andrapidamplificationofcDNAends(RACE)methods，andthecarboxylesterasegenewasnamedAgCarE,andinsertedintoEscherichiacoli．ThecarboxylesteraseactivityofAgCarEwascharacterizedwiththea-NAasasubstrateanditsenzymeactivitywasanalyzed．[Result]111eAgCarEis1

6、946bpinlength．andtheopenreadingframeencodes526aminoacids(GenBankaccessionnumberisJF970181)．ThepredictedisoelectricpointofAgCarEis6．08．TheAgCarEpossessesacatalytictriad,consistingofaSer,aHisandaGluresidue(Ser186，Glu313andHis434)，whichischaracterizedbycarboxylicesters(EC：3．1．1．一)．TheAgC

7、arEwasrecombinedintopET21bvector．ThentheHISfusionproteinwasexpressedbyinductionwithIPTGTheresultofSDS-PAGEandWestern—blotanalysisshowedthattheAgCarEproteinfromA．glycineswasexpressedinEcoliBL21whichinducedbyIPTG,anditsMWwasfoundtobeabout59kD．I_similarasthepredictedresult．Theactivityfor

8、AgCar