aiv神经氨酸酶基因的克隆表达及抗病毒活性分析

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1、优秀毕业论文IAIV神经氨酸酶基因的克隆表达及抗病毒活性研究研究生：任丽伟导师：孥碧春专业：动物遗传育种与繁殖(扬州大学动物科学与技术学院，扬州225009)摘要神经氨酸酶州A)是禽流感病毒的两种表面糖蛋白之一，属II型糖蛋白，是一种糖苷外切酶，具有酶切活性。NA具有双重功能，一方面对于流感病毒本身而言，它可以裂解唾液酸和附近的糖残基之间的n。糖苷键，有利于子代病毒释放出来，并且在子代病毒从宿主细胞表面释放时能防止病毒聚集，促进病毒穿过覆盖在呼吸道上皮细胞的黏液而扩散；另一方面对于宿主细胞而言，由于宿主细胞膜上的神经氨酸(又名唾液酸，SA．)是流感病毒的主要受体，流感病毒与宿主细

2、胞膜上SA受体结合后，才能进入细胞。而NA可以降解宿主细胞膜上的SA受体，抑制病毒进入细胞，使细胞免受触V的感染。由于NA这一独特功能特点对防治AIV具有重要的意义，使其成为国内外抗禽流感病毒研究的热点之一，同时也为制备抗禽流感转基因家禽提供了新思路。本研究通过克隆NA基因，进行体内外表达、亚细胞定位及抗病毒活性检测，旨在探索将NA基因用于研制抗病转基因家禽的新思路。主要研究内容和结果如下：1．NA基因的克隆、序列分析及原核表达。设计合成NA基因特异性引物，以质粒pGEM．T-NA为模板，采用大引物PCR定点诱变技术将NA基因突变修正后克隆至pMDl9．TVector中，酶切与测

3、序结果均表明pMDl9．T-NA构建正确，且NA基因ORF正确无误。然后将NA基因定向克隆入载体pGEX．6P．1中，构建原核表达载体pGEX。NA；经IPTG诱导表达，SDS．PAGE电脉分离，免疫印迹检测表明，重组NA蛋白获得了表达，且抗NA血清可识别表达产物。2．神经氨酸酶基因表达质粒免疫小鼠的研究。将NA基因定向克隆A．pcDNA3．0载体中，构建表达载体pcDNA3．0．NA，采用不同免疫方式，分别以不同剂量的表精品参考文献资料优秀毕业论文II达质粒免疫BALB／c小鼠；免疫后不同时间采集血液，分离收集血清；ELISA检测分析免疫效应。结果表明，所构建的表达质粒pcDN

4、A3．0．NA免疫小鼠后可诱导机体产生特异性抗体。3．体外重组神经氨酸酶的表达及其亚细胞定位研究。构建携带有EGFP报告基因融合表达载体pcDNA3．0／EGFP．NA，并与pcDNA3．0．NA分别用PEI介导转染NIH．3T3细胞系。转染48h后，前者直接在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光在细胞中的位置，后者先经间接免疫荧光检测，然后再在显微镜下观察荧光在细胞中的位置。两种方法结果一致，荧光集中分布在胞质近胞膜，细胞核内无荧光。通过荧光在细胞中的分布将重组NA蛋白表达定位在细胞膜上。4．丰申经氨酸酶抗病活性的研究。构建的真核表达载体pcDNA3．0-NA，用PEI介导转染NIH．

5、3T3细胞，G418压力筛选获得阳性单克隆细胞系，经RT-PCR与WesternBlot均可检测到NA基因的表达。然后收集并纯化细胞蛋白，采用NDV-CEF微量细胞抑制试验，来确定NA蛋白的抗病毒活性。重组表达NA蛋白对抗新城疫病毒感染结果显示，重组NA蛋白具有一定的抗新城疫病毒生物活性。关键词：禽流感病毒；神经氨酸酶；克隆；重组质粒；抗病毒活性精品参考文献资料优秀毕业论文IIICh"ganmdEXlt三xpresslonOt“NANAGeneenefromII"omAIVVanIdentificationofItsAntiviralSpecificityM．S．Candidat

6、e：RenLi．weiAdvisor：Prof．LiBi．chunMajor：Animalgenetics，breedingandreproduction(CollegeofAnimalScienceandTechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou225009)AbstractNeuraminidase(NA)isoneofthetwosurfaceglycoproteinsfromtheavianinfluenzavirus，isatypeIIglycoproteinandaglycosideexonucleasewithdigestionac

7、tivity．NAhasadualfunction,ontheonehand，forthefluvirusitself,itCanbecrackingsialicacidandadjacentsugarresiduesbetweenthec【-glycosidicbond．whichisconducivetoreleaseprogenyviruses，andcanpreventprogenyvirusreleasingfromthehostcellsurfaceaggregati