甲基对硫磷水解酶基因的高效表达及酶活性分析

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1、万方数据2004年31(6)微生物学通报甲基对硫磷水解酶基因的高效表达及酶活性分析刘璐璐周亚凤张治平刘虹张先恩。(中国科学院武汉病毒研究所武汉4姗1)摘要：假单胞菌wBc．3的甲基对硫磷水解酶基因嘶在大肠杆菌系统删(DE3)，pEl32a(+)中实现了高效可溶性融合表达。表达的重组酶能够有效地被亲合层析纯化。酶学性质分析表明，重组酶对底物乙基对硫磷水解能力较野生酶相比有近4倍的提高，对甲基对硫磷和杀螟松的水解活力无明显变化。以融合蛋白形式存在的重组酶在室温及4℃下的贮存稳定性明显优于野生型酶。关键词：有机磷水解酶，硫氧还蛋白，融合表达中图

2、分类号：Q814．1文献标识码：A文章编号：0253．2654(2004)06_0cr77．06H瞰粕磐啪憾G呲D掣嘲醯嘶ofMeⅡlylP嗣悯胁ionHy由ok怫锄dA瑚dysisofmeEl硒咖eAc吐vi锣删khl跚OUYa_Fe甥m心G蕊一啦姗Hongm州GⅪ趾_EIl+(№m痂腑矿临魄y，a矗黜爿∞幽可旷&妇踯，‰430cr71)Ab醴眦：M酬删吼吣妇(MPH，E．c．3．1．8．1)溅舭啦‰胁锄螂印．贼一3，isol砒-ed锄did脚曲edby叫lab，惴鲫c。蛐镧删illE．∞如删(DB)，pEl32a(+)sy3l咖鹅so

3、lllble觚册胁ath油M．’nIe胤砌陆l舢tⅧ)H删ne耐y4～5foldlli扣specmcacti嘶to删加th舭血e∞zyme如mR∞幽m∞。叩．WB(：-3．hladdi6∞，thet}l∞IdgIal岫0ftheIecor曲h∞te11EyrIlew∞iII掣m硝Ⅲ一’paringwimtllewddty】pe即zyme．K叮啪柑s：m驴珊phosl)hon坞d镏捌iIlg即可nle，m佣，c觇n，Fhsioll懿pI鹄sion微生物能够降解有机磷农药u。]。2001年我们筛选出一株甲基对硫磷降解菌，命名假单胞菌(＆舭，麟

4、sp．)WBc一3，它可以彻底降解甲基对硫磷，并以甲基对硫磷为唯一碳源和氮源生长HJ，所分离得到的甲基对硫磷水解酶(Metllylp越曲ionhydmlase，MPH，E．c．3．1．8．1)还可以降解乙基对硫磷，杀螟松和毒死俾。该酶对甲基对硫磷水解酶的比活性是对乙基对硫磷水解酶比活性的15倍[5]。对应MPH的基因区段已经从假单胞菌中定位，并克隆到大肠杆菌pUc一18／DH5a。‰以Dmonnssp．wBc．3是天然进化的产物，产酶量有限。本实验选择AD494(DE3)／pErl32a(+)大肠杆菌载体系统，成功地实现了M1)H在异源宿

5、主中的大量表达，获得重组MPH，通过对重组酶的酶学性质分析意外地发现，重组酶对底物一乙基对硫磷的催化动力学常数发生了较大变化。本文报道有关实验结果。’联系人Td：027-87lsr7105，F酲：027—87199492，Bmail：妇秘@mail．Illost．秽．∞收稿日期：2004一吆．29，修回日期：20啤明．兹万方数据1材料与方法微生物学通报2004年31(6)1．1菌株，质粒及主要试剂飚l。dDmo麟sp．WBc一3由本实验室分离¨j，大肠杆菌表达系统AD494(DE3)，pET32a(+)由胡勤学老师提供。重组系统删(DE3

6、)／pEl32a(+)一，啦，BL21(DE3)／pEB2a(+)一，础，A肚I舛(DE3)／pErI’5孙，础，和DH5√pUCl8一，n以均由本室构建。限制性内切酶、Pyrc眈stDNA聚合酶、T4DNA连接酶购自7rak锄公司。甲基对硫磷(纯度为99％)购自湖北沙隆达农药厂。乙基对硫磷(纯度为99％)和杀螟松(纯度为99％)购自沈阳化工研究所。蛋白浓度测定试剂盒系眦RCE公司产品。阳离子交换层析柱材料cM．sephamseFktnow为si鲫a产品。金属螯合层析柱材料Ni2+一NrllA为Nov明en产品。TAION蹦supemow

7、Resin为cLONrIEcH产品。实验中所用其它化学试剂均为分析纯。PCR引物由上海生工公司合成，DNA测序由上海博亚生物工程公司完成。1．2删咖基因的P哩扩增及克隆以质粒pUCl8一—nph为模板，根据测序结果设计引物，扩增两端带E幻RV和硒oI位点的玎枷基因编码序列，合成的引物为5’一GGAAGATA，I℃ArI℃CCCcrI．GAAGAA一3’和5’．CAa℃I℃GAGT℃ACrlwⅪG(汀飓Ac一3’。在50止的PCR反应体系中含1×啪bestDNA聚合酶缓冲液，o．0002Ⅱ10l／L的心m，，o．0015In洲L的M聋+，o

8、．5止的P娜kst酶(5u／皿)。PCR条件为94℃，5IIlin；94℃，1IIlin，53℃，1IIlin，72℃，1IIlin，25个循环；72℃，10lIlin；4℃，10IIlin。