寡养单胞菌g1菌mpd基因的克隆及甲基对硫磷水解酶的性质研究

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1、０３６４分类号；单位代码；１密级：学号；１２７２０５０８签歡念也乂葦学位论文真养单胞菌Ｇ１菌基因的克隆及甲基对硫磯水解酶的性质研究Ｔｈｅｓｔｕｄ〇打ｔｈｅｒｏｅｒｔｉｅｓｏｆｍｅｔｈｌａｒａｔｈｉｏ打ｙｐｐｙｐｈｄｒｏｌａｓｅａｎｄＣｌｏｎｉ打ｏｆｔｈｅＪｅｎｅｆＶｏｍｙｇ琴ｇｓｔｒａｉｎＧ１研巧生：指导教师：花日巧教授合作指导教师：ｉ－申请学位口类级另ｊ：Ｘ学硕上专业名称：环境工耗

2、研究方向：微生物降解所在学院：资源与环境学院巧答辩委员会主席：不入作年月独创性声明本人声明所呈的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，験了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方夕ｈ，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名；旅瑪签字曰期：立巧？６月＾曰学位

3、论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文文的件规定，有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子文，允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽农业大学可Ｗ将学位论文的全全文部数据或部库分内容编入有关数据库进行检索，收录到《中国学位论学位论》，可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编文，向社会公众提供信息服务。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）。指签学位论文作者签名：导教师签名：子昧馬日期：如＾月＾日签于日期：年月日学工作位单论文位

4、作者毕业后去向；通信地址：电话：：邮编：摘要本实验室分离筛选出的微嗜酸寡养单胞菌（Stenotrophomonasacidaminiphila）G1能够降解毒死蜱（CP）、甲基对硫磷（MP）、辛硫磷、二嗪磷、三唑磷（TAP）、丙溴磷。本文将编码甲基对硫磷水解酶（MPH）的mpd基因，克隆到大肠杆菌上并成功表达，然后研究了温度、pH、有机溶剂甲醇等对MPH活性的影响，比较G1菌粗酶液与构建的大肠杆菌工程菌粗酶液对CP、MP、TAP的降解效果。从G1菌中克隆长度为996bp的mpd基因，构建重组质

5、粒，将该质粒转化到大肠杆菌，获得基因工程菌株，成功表达重组蛋白，重组后的mpd基因编码的甲基对硫磷水解酶（MPH），经IPTG诱导表达后蛋白约30KDa，检测其酶活，重组后的蛋白能降解MP。在研究温度对MPH活性影响的时候，研究发现当温度为47℃时，底物MP的降解率最高，说明MPH最适反应温度为47℃。在pH对MPH活性影响的实验中，在碱性条件下，底物MP的降解率均高于在中性条件下，这说明MPH在碱性条件中的活性高，通过实验发现，MPH的最适反应pH为9.1。在研究有机溶剂甲醇对MPH的活性影响实验时，实验结果显示

6、，当添加的甲醇在整个体系的体积比为6%～50%之间时，这可以提高MPH的活性，因为底物MP的降解率明显要高于不加任何甲醇的对照，当添加的甲醇体积比超过50%后，MPH的活性被抑制，底物MP的降解很少，降解率小于不添加甲醇的对照组的降解率。实验结果发现MP的降解产物PNP对MPH的活性没有影响。在G1菌粗酶液与大肠杆菌工程菌粗酶液对两种农药的降解实验中，工程菌粗酶液对CP、TAP的降解率明显高于G1菌粗酶液，这是因为构建的工程菌大肠杆菌能够大量表达MPH。在添加相同的总蛋白量时，G1菌粗酶液对CP的降解率高于对TAP

7、的降解率。将G1菌粗酶液对MP的降解与G1菌对MP的降解结果比较，能够发现G1菌在经过16代传代后，活力明显下降，克隆的大肠杆菌因其能够大量表达甲基对硫磷水解酶蛋白，所以其对MP的降解率高。在降解实验中，当添加的工程菌总蛋白量相同时，TAP的降解率反而大于MP的降解率，这是因为MP的另一降解产物O,O-二甲基硫代磷酸对MPH有抑制作用。关键词：mpd基因粗酶液有机磷农药降解IAbstractAbacteriastrainStenotrophomonasacidaminiphilaG1hasbeenisolatedi

8、nthislabbefore.Thestraincandegradechlorpyrifos(CP),methylparathion(MP),phoxim,diazinephosphorus,triazophos(TAP),profenofos.ThempdgenefromstrainG1wasclonedintoE.coliinthispaper,then