临床分离嗜麦芽寡养单胞菌l1、l2酶基因克隆、测

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1、临床分离嗜麦芽寡养单胞菌L1、L2酶基因克隆、测【关键词】β摘要：目的了解临床分离嗜麦芽寡养单胞菌产L1、L2β内酰胺酶情况、酶基因定位及核苷酸序列进化和同源关系。方法PCR法扩增两种β内酰胺酶基因，通过克隆、测序、序列比对确定其亚型、基因进化、同源关系和基因所在位置。结果细菌染色体DNA和质粒DNA扩增L1、L2酶基因阳性，其序列具有明显异质性，两种酶基因位于12kb大小的质粒上。结论嗜麦芽寡养单胞菌绝大多数产生两种β内酰胺酶，酶基因变异和进化加速的驱动力部分可能与β内酰胺类抗生素的长期使用有关。　　关键词：β内酰胺酶；异质性；质粒　Cloning,sequencin

2、gandlocationofgenesencodingL1andL2βlactamasesABSTRACTObjectivesToinvestigatetheproductionofL1andL2βlactamases,locationandevolutionorhomologyofnucleotidesequencesoftheirencodinggenesinclinicalisolatesofStenotrophomonasmaltophilia.MethodsTasesencodinggenesplifiedbyPCR.Thesubtypes,evolution

3、orhomologyandlocationofgenesinedbygenecloning,sequencingandsequencescontrasting.ResultsL1andL2genesinchromosomesandplasmidsplified,thegenesequencesid.ConclusionMajorityofStenotrophomonasmaltophiliaisolatesproducedtases.Genevariationandevolutionaccelerationpartlycontributedtolongtimeuseso

4、fβlactams.　　KEYolecularheterogeneity;Plasmids嗜麦芽寡养单胞菌(又称嗜麦芽窄食单胞菌)为机会致病菌，广泛分布于自然界，医院环境和医务人员皮肤分离率较高。随着医源性介入技术的应用、免疫抑制病人的增加以及抗生素的大量使用增加了该菌的感染机会。该菌耐药性强，对临床多种抗生素包括多数β内酰胺类耐药，是目前医院内感染的重要致病菌之一，对β内酰胺类抗生素耐药主要因该菌产生两种β内酰胺酶(L1和L2酶)所致。本文从临床标本中收集13株嗜麦芽寡养单胞菌，研究其产两种β内酰胺酶的情况及酶基因位置，探讨耐药性产生的原因。1材料和方法1.1菌株所有

5、菌株于2003年3月～2004年7月解放军总医院的临床标本，由该院微生物科分离、培养、鉴定并保存。本次实验前所有菌株均经VITEK微生物鉴定系统重新鉴定，药敏试验应用复方磺胺甲口恶唑(SMZ/TMP)、亚胺培南(IMP)、左氧氟沙星(LVLX)和头孢他啶(CAZ)4种抗生素纸片并采用纸片扩散法进行常规药敏试验，耐药的判定点参照CLSI/NCCLS(2000年)标准。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853和大肠埃希菌ATCC25922。1.2质粒DNA的提取将13株临床菌株37℃过夜培养后，分别挑取1～2个菌落接种在5mlLB培养基中，220r/min37℃恒温摇床孵育

6、12h，采用碱裂解法抽提质粒DNA［1］，粗提物5μl直接加样于08%琼脂糖凝胶上电泳检测，溴化乙啶染色后收集图像。1.3染色体DNA的提取取上述菌液2ml采用天为时代离心柱型细菌基因组DNA提取试剂盒提取染色体DNA。1.4L1、L2酶基因的PCR扩增所有分子生物学试剂除特别注明外，均购自大连宝生物工程有限公司。根据GenBank注册的两种β内酰胺酶全基因序列设计L1酶PCR引物(注册号X75074)，扩增873bp的编码序列。L2酶PCR引物(注册号Y08562)，扩增长度为905bp。引物由上海生工生物公司合成。L1F：5′ATGCGTTCTACCCTGCTCGC

7、CTTCGCC3′L1R：5′TCAGCGGGCCCCGGCCGTTTCCTTGGCCAG3′L2F：5′CGATTCCTGCAGTTCAGT3′L2R：5′CGGTTACCTCATCCGATC3′PCR反应条件：反应体积为50μl，含10×LA缓冲液5μl，MgCl25μl，dNTP各8μl，LADNA聚合酶25U，基因组DNA模板10μl，引物(20μmol/L)1μl，双蒸水195μl。扩增L1的条件为：94℃预变性4min，然后94℃1min，68℃1min，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸5min。扩增L2的条件为：