土豆环氧化物水解酶基因的克隆、表达及其活性包涵体分析-论文.pdf

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1、食品与药品FoodandDrug2012年第14卷第07期237土豆环氧化物水解酶基因的克隆、表达及其活性包涵体分析李小灵，贺婉红，范立强，程安阳，王刚，潘忠孝，朱庆庆，盂军(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海200237)摘要：目的克隆、表达土豆环氧化物水解酶基因，分析其活性包涵体。方法提取土豆总RNA，以反转录获得的eDNA为模板进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增得到土豆环氧化物水解酶基因，构建大肠杆菌表达质粒pET-EEH，将重组表达质粒pET-P．EH转化E．coliBL21(DE3)。结果SDS—PAGE分析表明，IPTG诱导表达的重组土豆环氧化物水解酶在各种温

2、度下均主要以包涵体形式表达，只在15℃有微量可溶表达。酶活性分析表明，28℃表达的重组酶包涵体酶活性性为0．7U／mg。结论初步证实了存在活性包涵体的观点。关键词：土豆环氧化物水解酶，表达载体，重组表达，大肠杆菌，活性包涵体中图分类号：Q55文献标识码：A文章编号：1672．979X(2012)07-0237．04CloningandExpressionofEpoxiideHydrolasefromSolanumtuberosumandItsActiveInclusionBodiesAssayLIXiao—ling，HEWan—hong，FANLi—qiang，CHENGAn-yan

3、g，WANGGang，PANZhong-xiao，ZHUQing-qing，MENGJun(StateKeyLaboratoryofBioreactorneering，EastChinaUniversityofScienceandTechnology，Shanghai200237，China)Abstract：ObjectiveTocloneandexpressthegeneencodingepoxidehydrolaseofSolanumtuberosumandanalyzeitsactiveinclusionbodies．MethodsThetotalRNAwasextracte

4、d．ThegeneencodingepoxidehydrolaseofSolanumtuberosumwasamplifiedbyPCRwitheDNAasatemplateandligatedintopET-28a(+)resultinginpET-P．EH．RecombinantepoxidehydrolasewasobtainedafterexpressingpET-EEHinEscherichiacoliBL2I(DE3)．ResultsSDS—PAGEanalysisshowedthatunderdiferenttesttemperature，recombinantpota

5、toepoxidehydrolasewasmainlyexpressedasinclusionbodies．onlyslightlysolubleexpressionat15℃．Enzymaticassayshowedthatrecombinantpotatoepoxidehydrolaseinclusionbodiesexpressedat28℃hadspecificactivityof0．7U／mg．ConclusionThisstudycanpreliminarilyprooftheexistofacti~reinclusionbodies．KeyWords：potatoepo

6、xidehydrolase；expressionvector；recombinantexpression；Escherichiacoli；activeinclusionbody环氧化物水解酶(EC3．3．2-3)是一类能立体选合成因子，后者能进一步转化成白三烯、昆虫信息择性地将水分子加成到环氧底物上生成相应的1，2．二素、甾类物质、艾滋病病毒蛋白酶抑制剂等多种生物醇的酶，广泛存在于动物、植物、微生物体内。它们活性化合物，故环氧化物水解酶在医药、农药、化妆可降解生物体内外源[1]或内生[2的潜在毒性代谢中间品等行业具有广阔的应用前景[41。体，尤其是可致癌的多环芳烃环氧化物；参与哺乳动

7、土豆环氧化物水解酶属于cc／B一水解酶结构家族，物血压调节[2和白三烯A4、肝氧蛋白A3代谢引起的有宽泛和补充的底物选择性。本文将编码土豆环氧水炎症反应[3]；加强土壤细菌和植物对病原体的防御作解酶的eDNA插入质粒pET-28a(+)，在大肠杆菌中高用等，对生物体很重要。效表达，目的蛋白主要以活性包涵体形式存在，并且此外，该酶选择性地催化得到的具有光学活性的能有效地水解对硝基苯乙烯氧化物成为相应的二醇。环氧化合物和邻位二醇是精细有机合成中重要的手性以活性