绵羊SP-A基因的克隆、表达及活性检测.pdf

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1、分类号：密级：学号：2015201729单位代码：10759石河子大学硕士学位论文绵羊SP-A基因的克隆、表达及活性检测学位申请人王继雪指导教师孙延鸣（教授）申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称临床兽医学研究方向动物疾病诊断与防治所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2018年6月Cloning,expressionandactivitydetectionofSP-AgeneinsheepADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirement

2、sfortheDegreeofMasterofAgricultureByWangJi-xue(Clinicalveterinarymedicine)DissertationSupervisor:Prof.SunYan-mingJune,2018ShiheziXinjiangChina本研究受国家自然科学基金资助项目—《盘羊及其杂交羊SPLUNC1特性研究及抗肺炎支原体差异表达基因的筛选》（NO：31460686）资助。ThisresearchissurpportedbytheNationalNaturalScienceFoundationof

3、ChinanamedbyDifferentialExpressionGeneScreeningofMycoplasmaOvipneumoniaeandCharacterizationStudyofSPLUNC1inArgaliandTheirHybridSheep(NO：31460686).摘要巴什拜羊主要产于我国新疆塔城地区的裕民县，作为当地的优良品种，具有生长发育速度快、耐寒且抗病力强的特性，尤其对绵羊肺炎支原体表现为抗性。盘羊是体型最大的羊属动物。将父代盘羊与母代巴什拜羊杂交后，其后代羊具备了盘羊体格大的特点以及巴什拜羊羔羊阶段发育速度

4、快的遗传特性，但其易患绵羊肺炎支原体，成活率较低。肺表面活性物质相关蛋白A(Pulmonarysurfactant-associatedproteinA,SP-A)是一种亲水性糖蛋白,作为C-型凝素家族成员中一员，在肺的天然免疫反应以及局部防御中起着非常重要的作用，。目的:本研究分别克隆巴什拜羊及其与盘羊杂交羊SP-A基因的cDNA全长序列，并与其它品种的羊和动物进行对比研究，并对巴什拜羊及其与盘羊杂交羊的SP-A基因进行真核表达，最后通过研究重组SP-A蛋白(Recombinantpulmonarysurfactant-associated

5、proteinA,rSP-A)对体外培养的绵羊肺炎支原体（Mycoplasmaovipneumoniae，Mo）生长的影响来检测其活性，为巴什拜羊及其与盘羊杂交羊SP-A蛋白的体外功能的研究奠定了基础。方法：（1）巴什拜羊及其与盘羊杂交羊SP-A基因的全长cDNA序列的克隆：分别采集巴什拜羊及其与盘羊杂交羊肺组织样品，Trizol法分别提取两种羊肺组织总RNA，参考GenBank中绵羊的SP-A基因序列设计特异性引物，然后用RACE法分别对巴什拜羊及其与盘羊杂交羊SP-A基因的3’端和5’端序列进行克隆，经公司测序后，将获得的序列用DNAMA

6、N软件进行拼接最终获得两种羊SP-A基因的全长cDNA。分别将克隆得到的巴什拜羊及其与盘羊杂交羊SP-A基因与其它动物进行同源性分析。（2）巴什拜羊及其与盘羊杂交羊SP-A基因的cDNA序列的生物信息学分析：通过相关文献获取在线生物信息学分析工具的网址以及生物信息学相关软件，然后用这些工具和软件分别对获得的巴什拜羊及其与盘羊杂交羊SP-A基因cDNA序列进行分析，主要分析内容为SP-A基因的核酸序列、亲/疏水性、SP-A蛋白的信号肽以及编码氨基酸、SP-A蛋白亚细胞定位、蛋白的高级结构以及系统进化树分析。（3）巴什拜羊及其与盘羊杂交羊SP-A

7、基因真核表达及蛋白纯化：根据RACE法克隆出的两种羊的SP-A基因cDNA序列来设计特异性引物，使用RT-PCR法分别扩增出两种羊的SP-A基因的ORF，将扩增出的ORF片段与pPIC9K载体相连接构建重组表达质粒pPIC9K-SP-A，将重组表达质粒线性化以后用电击转化的方法将其电转化到巴斯德毕赤酵母GS115中，并利用甲醇对重组菌株GS115/pPIC9K-SP-A进行诱导表达，SDS-PAGE检测rSP-A的表达并用WesternBlotting法鉴定目的蛋白rSP-A，最后用镍柱亲和层析法分别对两种羊重组毕赤酵母GS115表达的rSP

8、-A进行纯化。（4）巴什拜羊及其与盘羊杂交羊rSP-A对Mo生长的影响：利用平板菌落计数法检测巴什拜羊及其与盘羊杂交羊rSP-A对体外培养的Mo生长的影响。I结果：