绵羊splunc1基因的克隆、表达及活性检测

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1、分类号：密级：学号：2012103011单位代码：10759石河子大学硕士学位论文绵羊SPLUNC1基因的克隆、表达及活性检测学位申请人陈凯丽指导教师孙延鸣教授申请学位门类级别理学硕士学科、专业名称动物学研究方向整合动物学所在学院生命科学学院中国·新疆·石河子2015年6月GeneCloning,ExpressionandActivityDetectionofSPLUNC1inSheepADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheR

2、equirementsfortheDegreeofMasterofNaturalScienceByChenKai-li(Zoology)DissertationSupervisor:Prof.SunYan-mingJune，2015ShiheziXinjiangChina本研究受国家自然科学基金资助项目-《盘羊及其杂交羊SPLUNC1特性研究及抗肺炎支原体差异表达基因的筛选》（NO：31460686）资助。ThisresearchissurpportedbytheNationalNaturalScienceFounda

3、tionofChinanamedbyDifferentialExpressionGeneScreeningofMycoplasmaOvipneumoniaeandCharacterizationStudyofSPLUNC1inArgaliandTheirHybridSheep(NO：31460686).摘要绵羊支原体肺炎是一种能引发绵羊以咳嗽、喘气、渐进性消瘦及肺间质的增生性炎症为特征的慢性呼吸道疾病，对养羊业危害严重。短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆基因1（shortpalate，lungandnasalepitheliu

4、mclone1，SPLUNC1）是一种在呼吸道上皮高表达的蛋白质分子，参与了宿主防御活动，具有抗菌和抗炎的功能，同时还能抑制肺炎支原体生长。目的：本研究通过克隆巴什拜羊与湖羊的SPLUNC1基因cDNA全长序列，对其进行生物信息学分析，通过真核表达巴什拜羊与湖羊的SPLUNC1基因，研究重组SPLUNC1蛋白对绵羊肺炎支原体的作用，验证其生物活性，为下一步研究绵羊SPLUNC1蛋白的生物学功能奠定基础。方法：（1）巴什拜羊与湖羊的SPLUNC1基因全长cDNA的扩增：根据GenBank上已报道的牛的SPLUNC1基因序

5、列，设计引物，使用RACE技术分别克隆巴什拜羊与湖羊的SPLUNC1基因的3’端序列和5’端序列，并测序、拼接获得巴什拜羊与湖羊的SPLUNC1基因的全长cDNA序列。（2）巴什拜羊与湖羊的SPLUNC1基因全长cDNA的生物信息学分析：利用生物信息学软件及在线分析工具对获得的巴什拜羊与湖羊SPLUNC1基因全长cDNA序列进行核酸及其编码蛋白信号肽、亚细胞定位、二级结构、三级结构、进化树等生物信息学分析。（3）巴什拜羊与湖羊的SPLUNC1基因的克隆与表达：使用PCR方法扩增出巴什拜羊与湖羊的SPLUNC1基因的开放

6、阅读框序列，并将该序列连接至pPIC9K真核表达载体，构建pPIC9K-SPLUNC1表达质粒，转化至巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中进行诱导表达，优化诱导表达条件并对表达产物进行SDS-PAGE和WesternBlotting分析鉴定。（4）重组巴什拜羊与湖羊的SPLUNC1蛋白的纯化与生物活性研究：利用Ni柱纯化方法分别对重组巴什拜羊与湖羊SPLUNC1蛋白进行纯化，将纯化的蛋白作用于绵羊肺炎支原体，使用荧光实时定量法检测纯化蛋白对绵羊肺炎支原体的作用。结果与结论：（1）巴什拜羊、湖羊SPLUNC1基因全长分别

7、为1095bp和1091bp，核苷酸相似性为99%。（2）巴什拜羊、湖羊SPLUNC1的核苷酸序列有五处核苷酸碱基差异，但是二者的开放阅读框均为768bp，编码氨基酸相同，均为255个氨基酸。SPLUNC1蛋白质的分子量为26.53KD，理论等电点为5.07。SPLUNC1蛋白N端存在信号肽，亚细胞定位在细胞外。SPLUNC1蛋白质的二级结构主要为α螺旋和无规则卷曲。该蛋白由4股反平行的肽段形成的β折叠片和2个α螺旋组成的桶型结构域组成。系统发育树分析结果说明，SPLUNC1蛋白与山羊首先聚为一类，后与牛聚为一类，这与

8、动物学分类结果一致。（3）在巴斯德毕赤酵母GS115中成功表达巴什拜羊与湖羊重组SPLUNC1蛋白，经SDS-PAGE检测发现，蛋白的分子量均为25.53kD，且在甲醇诱导72h表达的蛋白含量较高，经WesternBlotting检测证实表达蛋白为目的蛋白。（4）SDS-PAGE检测纯化的重组蛋白，结果显示为单一的条带，且分子量为