绵羊kap1.3基因启动子的克隆及表达活性分析

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1、分类号：密级：学号：2009108005单位代码：10759石河子大学硕士学位论文绵羊KAP1.3基因启动子的克隆及表达活性分析研究生朱汇石国庆（研究员）指导教师张红琳（副教授）代蓉(副研究员)申请学位门类级别农学硕士学位学科、专业名称动物遗传育种与繁殖研究方向动物繁殖技术所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2012年6月TheAnalysisofSheepKAP1.3GenePromoterCloningandExpressionActivityADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInFulfillmentoftheRequir

2、ementsFortheDegreeofMasterofAgricultureByZhuhui(AnimalGenetics,BreedingandReproduction)DissertationSupervisor:Researcher.Shiguo-qingJune·2012学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：时间：年月日学位论文版权授权书本人完全了解

3、石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日摘要从1985年利用显微注射法成功获得世界上第一只转基因羊开始，各国致力于转基因羊方面的研究，克隆和转基因技术已成功应用于转基因育种和生物反应器制备等方面的研究。上世纪90年代以来，在"863"计划等重大项目的支持下，由中国农业大学农业生物技术国

4、家重点实验室主持的转基因山羊—乳腺生物反应器的研究工作取得了成功。外源基因在动物体内的有效特异性表达，是制作稳定、高效表达外源基因的转基因个体，实现外源基因所显示出的有益性状以及进行高纯度药物蛋白的大规模、低成本生产的前提条件。要实现这一目标就首先需要获得能够特异高效启动外源基因表达的调控序列。选择在绵羊毛囊组织特异高表达的KAP1.3基因，通过PCR方法克隆得到该基因的5`调控序列，利用预测启动子区域的在线软件（Promoterpredictions、Promoter2.0等）预测KAP1.3基因上游5’端调控序列分析，确定-900~+309区域为绵羊KAP1.3基因启动子区

5、，在-904、-701、-565、-168、-165、-82以及+25、+56存在转录因子结合位点，其中-904、-168、+25和+56分别是bHLH，Sp1，C/EBP，NF转录因子的结合位点，-165及-82为CAATbox，TATAbox。为明确扩增得到的KAP1.3基因5`端序列不同区段对启动子活性的影响，通过PCR方法扩增了长度为1253bp，1016bp，703bp，504bp和313bp的5个片段，分别命名为P1，P2，P3，P4和P5。利用高灵敏且稳定性好的荧光素酶分析系统，将扩增得到的目的片段与pGL4.10载体经Kpn1和XhoI双酶切后连接，构建了5个重

6、组质粒（pGL4.10-P1至pGL4.10-P5）。测序鉴定与NCBI上（NM_001159761）序列只有个别碱基突变，但各转录因子结合位点和核心启动子区域相同。以小鼠成纤维细胞、鸡输卵管上皮细胞和293细胞这三种来源于不同动物和不同组织的细胞作为检测启动子活性的细胞，共转染pGL4.10-P质粒和内参对照pGL-TK质粒，检测含有不同启动子片段的质粒在各细胞中荧光素酶的活性，萤火虫荧光素酶与内参质粒中海肾荧光素酶的相对活性即反应出不同启动子片段在不同细胞中的表达活性。结果表明，除片段P5外，其他片段均具有不同程度的表达活性，且在小鼠成纤维细胞中的表达活性明显高于鸡输卵管上

7、皮细胞及293细胞对照组，表现出明显的特异性表达。核心启动子区域位于-194至+4区段，-707至-394之间存在潜在增强子调控序列，而-394至-195之间可能含有一些负调控序列。P1，P2片段在小鼠成纤维细胞中的表达活性明显高于其他片段，但在其他两组细胞系中却与其他片段相似，推测在-944至-394区段可能与基因组织特异性表达相关。本研究扩增得到不同长度的绵羊KAP1.3启动子片段，利用生物信息学方法预测了转录因子的结合位点，成功构建了启动子活性检测载体5个，在3个细胞系中利用荧光素酶分