大豆油酸脱氢酶基因启动子的克隆及其表达活性分析-论文.pdf

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1、中国生物工程杂志ChinaBiotechnology，2013，33(4)：80—84大豆油酸脱氢酶基因启动子的克隆及其表达活性分析术赵艳沙伟张梅娟杨晓杰范震宇王艳梅(1齐齐哈尔大学生命科学与农林学院齐齐哈尔1610002齐齐哈尔市龙沙公园齐齐哈尔161006)摘要大豆油酸脱氢酶(FAD2—1B)基因是种子特异表达基因，利用PCR方法从大豆基因组DNA中分离FAD2—1B基因的启动子片段，命名为FP。PLACE在线启动子预测工具分析表明：序列中含有多种典型的种子特异性表达元件，如Skn-1motif、AACA

2、CA、SEF4motif、E．box、ACGT等。将克隆得到的FP片段替换pCAMBIA1301中的CaMV35S启动子，构建表达载体pCAM-FP。通过农杆菌介导法在大豆各组织中进行瞬时表达，GUS组织化学染色显示FP驱动GUS基因在大豆根、茎、叶中基本不表达，在种子中有较高的表达活性，推测FP启动子具有种子特异表达活性。关键词大豆油酸脱氢酶基因启动子瞬时表达中图分类号Q786油酸脱氢酶(FAD2)是脂肪酸合成途径中催化油其表达特异性，根据GenBank中的．1B基因序列酸C。：、C。，之间形成双键的酶。油

3、酸(单不饱和脂肪及大豆的基因组序列，采用PCR方法扩增FAD2．1B启酸)具有高营养和保健价值，而多不饱和脂肪酸又是动子序列，并将其构建在含有GUS报告基因的表达载细胞膜和贮藏油脂的主要成分，因此FAD2的表达或抑体中，并转化农杆菌EHA105，通过GUS组织化学染制，影响各种不饱和脂肪酸的比例，与种子油脂品质色，分析其在大豆各组织中的瞬时表达情况，旨在明确及其商品化应用密切相关。FAD2—1B基因启动子的组织表达特性。研究表明，拟南芥中FAD2基因是单拷贝的，在1材料与方法芝麻、棉花、玉米H、油菜中至少有两

4、个FAD2的亚型。大豆中的FAD2-2基因为组成型表达，FAD2．基1．1材料因为种子特异表达。由于稳定性及磷酸化作用不同，大豆品种吉豆2号、大肠杆菌DH5ot、根瘤农杆菌FAD2一基因又分为FAD2．1A和FAD2．1B两种J。LiEHA105和pCAMBIA1301质粒为齐齐哈尔大学分子生等对大豆中FAD2—1B基因进行研究发现，在正常的物学实验室保存；限制性内切酶PstI、NcoI、pMD18一T克野生型酵母细胞中不存在亚油酸，但在含有大豆FAD2．隆载体、ExTaq、T连接酶均购自TaKaRa公司，D

5、NA凝1B基因载体转化酵母的细胞中能够积累一定量的亚油胶回收试剂盒购自维特洁公司，PCR引物和DNA序列酸，表明该基因与多不饱和脂肪酸的合成密切相关。测定由上海生工生物工程公司完成；5．溴4．氯．3．吲哚半定量RT—PCR分析表明D2一J日基因特异地在大豆葡糖苷酸(X-Gluc)购自Clontech公司，其他试剂均为种子中表达，其上游启动子可能具有种子特异表达进口或国产分析纯。调控特性。1．2FAD2-1B基因启动子的克隆与序列分析本实验为明确FAD2-1B基因启动子的调控序列及以大豆叶片为材料，采用CTAB

6、法提取大豆的基因组DNA。根据大豆D2一JB基因的核苷酸序列收稿日期：2012-10-12修回日期：2012．12．15黑龙江省教育厅科学技术研究资助项目(12521611)(DQ532370)，在大豆基因组序列(http：／／www．}电子信箱：zhaoyard053877@yahoo．con1．caphytozome．net／soybean)中搜索该基因5端上游序列。2013，33(4)赵艳等：大豆油酸脱氢酶基因启动子的克隆及其表达活性分析83corepromoter—thegatewaytotransc

7、ription．CurtOpinCellBiol，参考文献2008，2O(3)：253-259．[12]WuCY，WashidaH，OnoderaY，eta1．Quantitativenatureof[1]肖钢，张宏军，彭琪等．甘蓝型油菜油酸脱氢酶基因(fad2)thePrelamin·box，ACGTandAACAmotifsinariceglutelingene多个拷贝的发现及分析．作物学报，2008，34(9)：1563．1568．promoter：Minimalcis·-elementrequirem

8、entsforendosperm·-specificgeneexpression．PlantJ，2000，23(3)：415-421．XiaoG，ZhangHJ，PengQ，eta1．Screeningandanalysisof[13]FauteuxF，StremvikMV．Seedstorageproteingenepromotemmutiplecopyofoleatedesaturasegene