砀山酥梨果实木质素合成关键酶基因comt的克隆和表达分析

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1、分类号：单位代码：10364密级：学号：11720422安徽农业大学学位论文砀山酥梨果实木质素合成关键酶基因COMT的克隆和表达分析CloningandExpressionAnalysisoftheKeyEnzymeCOMTGeneofLigninSynthesisinPyrusbretschneidericv.DangshanSuFruit研究生：程敏指导教师：蔡永萍教授申请学位门类级别：理学硕士专业名称：细胞生物学研究方向：分子细胞生物学所在学院：生命科学学院答辩委员会主席：二零一四年六月1万方数据独创性声明

2、本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编

3、学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日第一导师签名：时间：年月日2万方数据本论文得到了以下科研项目的资助：国家自然科学基金专项：异花授粉调控梨石细胞木质素合成的分子机理（项目编号：31171944）万方数据摘要砀山酥梨(Pyrusbretschneidericv.DangshanSu)原产安徽省砀山县，栽培历史悠久，是我国主要的梨出口品种。近几年来，由于气候变化、栽培管理粗放等原因，梨果实中石细胞含量增

4、加，影响其食用品质和经济价值。梨果实中石细胞是一种厚壁组织细胞，是次生壁在初生壁上沉积形成的，与木质素的合成、转运及沉积均密切相关。咖啡酸氧甲基转移酶(COMT)是木质素合成的关键酶，主要参与S-木质素的合成。砀山酥梨果实COMT基因的克隆，目前未见报道。因此，克隆和鉴定砀山酥梨果实中COMT基因，探讨COMT的分子特性，对利用分子生物学技术调控梨木质素的合成和石细胞的发育意义重大。本研究以砀山酥梨果实为材料，克隆其COMTcDNA全长，进行生物信息学分析，进行原核表达和实时荧光定量表达分析，另外还成功构建了真核

5、表达载体，为后期蛋白定位和遗传转化奠定基础。主要研究结果如下：1.利用RT-PCR技术并结合RACE方法得到砀山酥梨咖啡酸氧甲基转移酶(COMT)基因的全长cDNA，命名为PbCOMT，GenBank登录号为KC905086。PbCOMT基因全长1371bp，其开放阅读框为1098bp，编码365个氨基酸。2.生物信息学分析结果为：PbCOMT蛋白的理论分子量约为40KD，理论等电点为5.61。PbCOMT氨基酸序列与苹果的COMT氨基酸同源性最高，相似性达94%。PbCOMT蛋白二级结构中含有34.25%α螺旋

6、，16.44%伸展链，49.32%的无规则卷曲。PbCOMT蛋白为疏水性蛋白，其N端无信号肽，说明该蛋白可能定位在细胞质基质中，属于非分泌性蛋白。PbCOMT蛋白的N末端有调节蛋白质二聚作用的结构域，同时也发现了催化SAM的甲基转移酶结构域。3.将该基因重组到表达载体pET-32a(+)中进行原核表达，经IPTG诱导，SDS-PAGE检测表明，PbCOMT基因能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，电泳检测到一条大约60KD的外源蛋白，与预测的融合蛋白分子量相符。4.实时荧光定量表达分析发现，不同发育时期(23d，

7、39d，47d，63d和125d)砀山酥梨果实PbCOMT基因表达量呈现先增加后下降的趋势，在63d时达到最大表达量。花后47dPbCOMT基因表达量，果中部＞近果核＞近果皮，并且果中部明显高于近果皮和近果核；而63dPbCOMT基因表达量，近果核＞近果皮＞果中部。5.以pCAMBIA1301-EGFP为真核载体质粒，成功构建了1301-PbCOMT-EGFP融合表达载体并进行亚细胞定位分析。关键词：砀山酥梨，PbCOMT，生物信息学分析,原核表达，荧光定量表达I万方数据AbstractPyrusbretschn

8、eidericv.DangshanSu,whichoriginatedinDangshaninAnhuiProvince,China,hasalongcultivationhistoryandremainsthemainexportproductofthisregion.However,thelocaleconomyassociatedwiththisfruitisund