蓖麻蚕孵化酶基因的克隆及其转基因载体构建

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1、学校代码：10289分类号：S8密级：公开学号：122310018江苏科技大学硕士学位论文蓖麻蚕孵化酶基因的克隆及其转基因载体构建研究生姓名贺华导师姓名唐顺明申请学位类别农学硕士学位授予单位江苏科技大学学科专业特种经济动物饲养论文提交日期2015年4月23日研究方向昆虫分子生物学论文答辩日期2015年6月3日答辩委员会主席张国政评阅人2015年6月10日分类号：S8密级：公开学号：122310018江苏科技大学硕士学位论文蓖麻蚕孵化酶基因的克隆及其转基因载体构建学生姓名贺华指导教师唐顺明副研究员江苏科技大学二O一五年六月AThesisSubmittedinFulfillme

2、ntoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceMolecularcloningofhatchingenzymegeneinPhilosamiaCynthiariciniandconstructionoftransgenicrecombinantplasmidSubmittedbyHeHuaSupervisedbyTangShunmingJiangsuUniversityofScienceandTechnologyJune,2015江苏科技大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究

3、工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：年月日江苏科技大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于：(1)保密□，在年解密后适

4、用本授权书。(2)不保密□。学位论文作者签名：指导教师签名：年月日年月日摘要摘要蓖麻蚕（Philosamiacynthiaricini,eri-silkworm）是室内饲养的重要经济昆虫，以蓖麻叶为主要饲料，属于鳞翅目大蚕蛾科。包括家蚕、柞蚕、野蚕、桑蟥及小菜蛾在内几种鳞翅目昆虫孵化酶基因cDNA业已克隆报道，本文我们对蓖麻蚕孵化酶基因进行研究。根据已报道鳞翅目昆虫孵化酶的基因保守序列，我们设计合成兼并性引物，以蓖麻蚕转青卵cDNA为模版，克隆获得部分蓖麻蚕孵化酶基因（PhilosamiaCynthiaricinihatchingenzyme,PcrHE）序列，然后通过RA

5、CE-PCR和序列拼接获得蓖麻蚕孵化酶基因全长序列。PcrHE全长cDNA为962bp，其中包含3’UTR、5’UTR和885bp的开放阅读框，共编码294个氨基酸，N端16个氨基酸残基为信号肽序列。序列比对的同源性分析显示PcrHE与ApHEL，BmandHE，BmHE，RmHE，PxHE，BmHEⅡ，CuefHCE，DmHEHS，MLCE，XHE，EHE12，ZHCE1，MHCE23，TuHE，Aatacin和QHE的蛋白功能区序列相似性分别为92.3%，84.2%，83.3%，82.4%，79.5%，76.1%，44.7%，43.6%，33.9%，33.7%，32.3

6、%，32.3%，32.1%，31.7%，31.4%和30.8%，根据进化树分析显示蓖麻蚕与柞蚕的亲缘关系最近。根据同源建模的方法对PcrHE进行了三维结构的预测，显示其与蝲蛄金属蛋白酶的三维结构相似，利用PROCHECK对所建蛋白三维结构进行了评价，模拟得到的PcrHE蛋白三维结构有90.2%位于合理区域内，理论上表明蛋白三维结构是可靠的。通过RT-PCR的方法我们发现，在蓖麻蚕卵胚胎发育期不同阶段中，可以在胚胎发育早期检测到PcrHE转录本，维持在较低水平，孵化时达到最高值，表明PcrHE可能与孵化过程相关。另外，PcrHE转录本可在幼虫的中肠和精巢中检测到，推测PcrH

7、E可能还有食物消化、精子发生等其它生物学功能。我们将PcrHE的成熟酶序列、去信号肽序列、ORF序列对应的基因序列分别克隆到原核表达系统pET28a中进行蛋白原核表达，SDS-PAGE电泳检测蛋白的表达，并用WesternBlot进行验证。最后我们克隆了家蚕孵化酶基因启动子（BmHEⅠp，BmHEⅡp），由其驱动蓖麻蚕孵化酶基因，分别构建了转基因重组质粒pSL-3XP3-EGFP/BmHEⅠp-PcrHE，pSL-3XP3-EGFP/BmHEⅡp-PcrHE，并尝试将其用显微注射方法导入到家蚕卵中，以期在个体水平验