草鱼明胶酶基因及其抑制剂基因的克隆和表达分析

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1、学校代码：10264研究生学号：M090101004上海海洋大学硕士学位论文草鱼明胶酶基因及其抑制剂基因题目：的克隆和表达分析CloningAndExpressionPatternsOf英文题目：GelatinaseGeneAndInhibitorsGeneInGrassCarp专业：水产养殖研究方向：水产动物种质资源与种苗工程姓名：徐晓雁指导教师：李家乐教授二O一二年四月六日上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外

2、，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导

3、教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注答辩地点答辩日期上海海洋大学硕士学位论文草鱼明胶酶基因及其抑制剂的克隆和表达分析摘要草鱼是我国乃至世界养殖产量最高的鱼类，具有悠久的养殖历史。目前，草鱼养殖病害严重，带来了很大的经济损失，开展草鱼免疫因子研究，开发防病产品、培育抗病力强的草鱼新品种是一条重要研究途径。明胶酶基因是一类重要的免疫因子，它包括基质金属蛋白酶-2（MMP-2）基因和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）基因。本文克隆了草鱼这2种明胶酶基因及其抑制剂——基质金属蛋白酶抑制剂-2b基因和热

4、休克蛋白60基因，分析了它们的理化性质、氨基酸结构，比较了它们的同源性，采用福尔马林灭活嗜水气单胞菌液对这些基因进行了诱导，研究它们在草鱼不同发育过程、不同组织及其受嗜水气单胞菌感染后的表达情况，取得了如下结果。1．通过同源克隆策略获得了草鱼MMP-2、MMP-9和HSP60基因部分cDNA片段，从本实验室已构建的草鱼头肾均一化文库中获得TIMP-2b基因部分cDNA片段；由RACE技术发现这4个基因的全长序列分别为3102bp，2880bp，2434bp，1224bp；分别含有编码658（1974bp），675（2025bp），575（1728bp

5、），218（657bp）个氨基酸的开放阅读框，MMP-2，MMP-9，TIMP-2b分别含有29，20，24个氨基酸的信号肽序列。2．BLAST分析发现，草鱼MMP-2，MMP-2，TIMP-2b和HSP60都是高度保守的蛋白家族成员，草鱼与鲤鱼的MMP-2、MMP-9氨基酸序列相似度最高，分别达到94%、89%；草鱼与斑马鱼TIMP-2b氨基酸序列相似度最高，为83.9%；草鱼与金丝鱼HSP60氨基酸序列相似度最高，达96.9%；选取各自蛋白家族不同物种氨基酸序列，通过MEGA5.0软件，使用NJ和ML两种方法构建系统进化树，均发现草鱼与其它硬骨鱼

6、类的的亲缘关系最近，这些结果都支持了传统的进化理论，反应了其实际的亲缘关系。3．多序列比对和蛋白功能结构域分析发现，MMP-2、MMP-9氨基酸序列均含有N端信号肽、前肽，插入催化结构域的3个重复的类纤维连接Ⅱ型蛋白结合区和C端的类血红素结构域，但他们的氨基酸序列一致度只有47.2%，表明他们I上海海洋大学硕士学位论文的功能具有一定差异性。草鱼TIMP-2b氨基酸序列包含一个信号肽，N-端和C-端2+结构域。草鱼HSP60氨基酸序列包含ATP/Mg结合位点、一个铰链结构域和一个环状寡聚结构。4．利用实时荧光定量PCR技术对健康草鱼各组织及使用灭活嗜水

7、气单胞菌诱导后4个基因的表达谱进行检测，结果显示：4个基因在所有被检测组织中均有表达，表明他们可能在草鱼体内发挥广泛的作用；MMP-2基因在血液、头肾和鳍条发现较低的表达水平，MMP-2基因经灭活的嗜水气单胞菌诱导，在脾脏和头肾组织表达量，4小时显著性上调，24小时显著下调；MMP-9基因和TIMP-2b基因均在血液、头肾、体肾和脾脏中显著高表达，草鱼MMP-9基因和TIMP-2b基因诱导后，所有组织的表达量均显著提高，MMP-2在肠组织的表达量变化不显著，MMP-9基因在头肾和心脏的的上调最具显著性；HSP60基因在血液和肝脏组织中具有显著高表达，

8、HSP60基因表达情况有明显时间节点，表达量在第三天达到峰值，第七天表达水平与对照组相似。分析健康草鱼和细菌