草鱼mhcⅱb和组织蛋白酶d基因的克隆、表达及多态性分析

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2、和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并向社会公众提供信息服务。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：垫导师签名：王妻符号说明lllllIIIIIIIIIIIIIlY2303635目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯IABSTRACT．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．III1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1草鱼⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11．2鱼类免疫系统及相关基

3、因的研究现状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．2．1免疫器官和组织⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．21．2．2免疫细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．21．2．3体液免疫因子⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．21．2．4主要组织相容性复合体(MAJORHISTOCOMPATIBILITYCO～tPLEX，MHC)⋯⋯31．2．4．3MIlE基因在生产上的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．71．2．5组织蛋白酶D(CATHEPSIN历基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯813请始轱术廊田．．．．．．1．3．1快速克隆cDNA末端技术(RAPIDAMPLIFICAT

4、IONOFcDNAENDS，RACE)⋯91．3．2巢式PER(NEST—PER)和降落PCR(TOUCHDOWNPCR)⋯⋯⋯．．101．3．3实时荧光定量PCR(REALTIMEOUANTIATIVEPCR)⋯⋯⋯⋯．111．4本研究的目的和意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．122材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯．．132．1试验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．1．1试验动物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．132．1．2嗜水气单胞菌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．1．3主要仪器设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

5、⋯⋯⋯⋯132．1．4主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．142．1．5常用溶液配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯142．2试验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯152．2．1引物合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．152．2．2总RNA的提取与质量检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．152．2．3草鱼基因组DNA的提取及检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．162．2．4反转录合成cDNA⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．172．2．5RACE扩增目的基因全长cDNA序列⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．172．2．6草鱼MHCIIB基因组序列扩增⋯⋯⋯⋯⋯

6、⋯⋯⋯⋯⋯192．2．7PCR产物片段回收⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192．2．8PCR产物与载体的连接⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．202．2．9大肠杆菌的转化及测序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．202．2．10生物信息学分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2l2．2．11草鱼删CIIB基因多态性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．212．2．12人工感染草鱼试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．212．2．13荧光定量PCR⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯223结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．233．1实时荧光定量PCR⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

7、．．233．2草鱼MHCIIB基因实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．243．2．1草鱼MHCIIB基因cDNA的克隆及序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯．243．2．2草鱼MHCIIB基因的多态性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．253．2．3草鱼MHCIIB进化树分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．283．2．4草鱼MHCIIB基因蛋白质空间结构⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．293．2．5草鱼MHCIIB基因mRNA水平分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯303．3草鱼CATHEPsIND基因试验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯323．3．1草鱼CathepsinD基因cDNA的克隆及序列分析⋯⋯⋯

8、⋯⋯．323．3．2草鱼CathepsinD基因序列比对和进化树分析⋯⋯⋯⋯⋯．．343．3．3草鱼CathepsinD基因mRNA表达分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯374讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯