尼罗罗非鱼mhc基因的克隆、表达及多态性研究

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1、山东农业大学硕士学位论文尼罗罗非鱼MHC基因的克隆、表达及多态性研究姓名：周芬娜申请学位级别：硕士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：王慧20120613山东农业大学硕十学位论文中文摘要主要组织相容性复合体(MajorHistoeompatibilityComplex，MHC)是脊椎动物中编码免疫球蛋白样受体的基因家族，常呈现出高度的遗传多样性，与动物的抗病性和生长发育等重要经济性状密切相关。本研究以我国重要的养殖鱼类尼罗罗非鱼为实验材料，采用PCR、同源克隆、RACE、RT．PCR等技术，对MHC家族IA、I

2、IA和IIB3个基因进行了克隆、表达与多态性分析。主要研究结果如下：(1)获得尼罗罗非鱼MHCIA基因eDNA的3’端序列，MHCIIA、MHCIIB基因的eDNA全序列：获得的MHCIA基因eDNA3’端序列长957bp，含666bp的CDS和291bp的3’．UTR区，其中3'-UTR区具有真核生物共有的加尾信号从TAAA和29bp的PolyA尾巴，其编码的221个氨基酸包含了部分的多肽结合区、全部的IGC区以及跨膜区和胞质区：MHCIIA基因eDNA序列全长1205bp(Omi．DBA*0101，Gen

3、ebank登录号：JF719813)，开放阅读框长720bp，编码的蛋白质分子包含1个信号肽、2个胞外结构域(a-I和a．2)、1个跨膜区和1个胞质区，存在4个保守的半胱氨酸残基以及丰富的磷酸化位点，与其他物种的相似性在23％．65％之间；MHCIIB基因eDNA序列全长1143bp(Omi．DAB*0101，Genebank登录号：JF713026)，包含35bp的5'-UTR、756bp的开放阅读框和352bp的3'-UTR，编码的蛋白质分子包含1个信号肽、2个胞外结构域(p·l和p一2)、1个跨膜区和1

4、个胞质区，存在丰富的磷酸化位点，与其他物种的相似性在27％到70％之间。(2)获得了MHCIIA及MHCIIB基因组DNA序列：MHCIIA基因组序列长1388bp，含4个外显子和3个内含子，外显子l编码信号肽区，外显子2编码a．1区，外显子3编码a．2区，外显子4编码跨膜区及胞质区；MHCIIB基因组序列长2428bp，含6个外显子和5个内含子，外显子l编码信号肽区，外显子2编码p．1结构域，外显子3和4J乓I州编码p．2结构域，外显子5和6编码连接肽、跨膜区以及胞质区。(3)MHCIIA及MHCIIB分子

5、均由多个基因位点编码，等位基因间均存在丰富的多态性，且变异主要集中在多肽结合区：从4尾健康的尼罗罗非鱼肝脏eDNA中共得到8个MHCIIA序列，8条序列间存在丰富的多态性且主要集中在a．1区，其中从1个个体获得4条不同的eDNA序列，这预示着尼罗罗非鱼MHCIIA基因至少存在2个基因座位；从5尾尼罗罗非鱼中获得10个MHCIIB序列且等位基因序列间存在丰富的变异，尼罗罗非鱼MHC基因的克隆、表达及多态性研究变异主要集中在B．1区，其中从同一个体获得5条不同的cDNA序列，预示着尼罗罗非鱼MHCIIB中至少有3

6、个基因座位。(4)RT-PCR分析结果显示，递呈外源性抗原的MHCIIA及MHCIIB基因在健康尼罗罗非鱼的脑、心、脾、肝、头肾、肠、肌肉、鳍、胸腺、性腺、鳃和胃12个组织中均有表达，但是表达量有所差异，体现了其表达与功能的适应性：MHCIIA基因在脾、肾、肠、鳃、性腺、肝、心脏组织中表达量很高，在鳔和肌肉中表达量最低；MHCIIB基因在脾、肾、鳃和肠中表达量最高，性腺、肝、心脏、脑、鳍、胃中表达程度中等，在鳔和肌肉组织中表达量最低。(5)人工感染嗜水气单胞菌，应用RT-PCR半定量技术，检测了感染后不同时期

7、尼罗罗非鱼5个组织(肝、脾、肾、鳃、肠)中MHCIIA及MHCIIB基因mRNA表达水平的变化。结果显示，5个组织中MHCIIA及MHCIIB基因的mRNA水平均发生了不同程度的变化，提示MHCIIA及MHCIIB作为重要的免疫因子，在清除病原的免疫反应中起着重要作用，可以考虑将其做为检测机体抗病力水平的一种指标。(6)分别根据MHCIA、IIA和IIB这3个基因氨基酸序列的IGC区构建了脊椎动物的系统进化树，结果表明其拓扑结构基本一致，说明这3个分子的IGC区序列可以作为研究鱼类种间进化关系的分子标记。关键

8、词：尼罗罗非鱼；MHC基因；克隆；表达；多态性Ⅱ山东农业大学硕士学位论文ABSTRACTMajorhistocompatibilitycomplex(MHC)isahighlypolymorphicgenomieregion、Ⅳitllallimportantroleintheimmunesystemofvertebrates．Thisresearchstudiedthecloning，polymo