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1、叶芽染色体制备技术（酶解法）植物叶芽染色体制备技术材料：1,植物材料：春夏季釆取2^3mm的芽尖。2,化学试剂:1）冰水：10mL小瓶分装蒸憎冰水，用以保存采集的新鲜芽尖。2）固定液：冰醋酸：无水乙醇=1:3,现用现配。3）酶解液：2.5%果胶酶（v/v）+2.5%纤维素酶（w/v）混合液加于75mMKCI+7.5mMEDTA制成的缓冲液。每次取用100-150uL,存储于・20°C（ps:0.5MEDTA溶液：37・224gEDTA二钠盐（C10H14N2O8Na.2H20,372.24）加200ml纯水或原子级水50ml~9.306g0.25M——100ml~9.30
2、6g*0.25M母液，实验欲用7.5mM,稀释比例为100:3,BP100体系，加入3份母液。）4）75mMKCI,PH7.0:1MKCI溶液过滤灭菌，使用前将其稀释至75mM溶液。例如：7.5mLIMKCI溶液+97.5mL蒸憾水5）辂硫酸：用于每次使用玻片之前清洗脱脂6）无水乙醇，丙酮（可选）1,器材及设备：1）显微观察：玻片（末端有磨毛处理最好），盖玻片，细蹑子，科普林染色缸。2)分子处理：0.5和l・5mL离心管,移液器和一次性枪头，用于过滤细胞碎片的lXlcm2的尼龙布片。4,设备要求:相差显微镜。实验步骤:1,组织收集：实验采用刚要破芽的芽尖材料，2-4cm,
3、每棵植物采取5-10个芽尖材料并置于冰水中23-27h以捕获分裂中期细胞。2,固定：将叶芽从冰水中取出，并在滤纸上吸干水分。然后放入到加入ImL冷固定液的离心管中，每个管子2・3枚芽尖。置于室温2h,期间换一次固定液。固定的芽尖在固定液中于・20°C保存，用时取出，保存时间不能超过一个月。3,酶解：用蒸惚水冲洗根尖并用水泡30mino去除芽尖外组织，留用内部小嫩芽(l-2mm)o2-3枚芽尖放于分装了100uL果胶酶/纤维素酶混合液的离心管中，室温处理3-5ho处理吋间长短取决于芽的大小和组织固定的时间长短，越小并就近处理的芽尖酶解时间越短。4,原生质体分离：在酶解混合液
4、中用200UL枪头破碎芽尖组织。然后用枪吸取悬浮液滤过尼龙网布到1.5mL敞口离心管中。滤过液要流到管底部。奔去尼龙网和细胞碎片。过滤的细胞/原生质体悬浮液可在4°C保存数小时。5,低渗：向装有原生质体悬浮液的离心管中加入1.5mL冷的75mMKCI溶液。轻轻混匀并静止5-7mino处理时间加长可优化染色体分散，但是不能过长，以保证此步骤的原牛质体完整。6,原生质体的清洗和固定：7000rpm,5min离心原生质体悬浮液,弃上清液。再加入ImL冰冷的固定液于原生质体颗粒。用之前的移液枪再次小心混合，使混合液悬浮。室温处理5min或者4°C处理更长时间，再次7000rpm5
5、min离心，弃上清固定液。重复处理两次。7,滴原生质体：向原生质体颗粒中加入50uL新鲜冷的固定液，并轻轻混合，使其成为悬浮液。10-20cm高处滴下原生质体液滴到冰冷的载玻片上，当液滴将耍干时，用无水酒精简略处理。在空气中自然干燥。显微镜检查染色体。视野中细胞核应该均匀分散，染色体分散良好并且无细胞壁及细胞质。玻片可保存于4°C干燥环境或者・20°C.可用于传统的胭脂红染色后的核型分析或荧光染色(DAPI和chromomycin)8,染色体原位杂交处理：在科普林染色缸屮用醋酸/酒精固定液固定玻片,室温一小时处理。用70%,90%和100%的酒精梯度脱水，每个处理3min
6、室温，然后在37°C培养箱中过夜烘干。玻片也可以再次处理：在丙酮中用密闭的容器室温处理lOmin,然后空气中自然干燥。果胶酶：Pectinase(SigmaP-9179)纤维素酶：CellulaseOnozukaRIO(Merck102321)銘硫酸：Chromosulfuricacid(Merck102499)丙酮科普林染色缸：CoplinjarsDAPI尼龙网布
