酱香型大曲中蛋白酶产生菌发酵条件及代谢产物研究毕业设计

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1、酱香型大曲中蛋白酶产生菌发酵条件及代谢产物研究答辩人：孙李平专业：生物科学课题研究目的和意义↓课题研究内容↓研究方法和研究思路↓预期研究结果课题研究目的和意义:对酱香型大曲中蛋白酶产生菌进行分离鉴定，并对其酶学性质进行研究，包括最适作用温度、最适pH、最适pH稳定性、最适热稳定性，从而发现酱香型大曲中蛋白酶产生菌发酵条件及代谢产物。有助于揭示酱香的形成机制，提高优质酒率，对我国整个酱香食品工业的发展都会起到重要的促进作用类，同时亦可能揭示出这些复杂酿造微生物间一些尚未知晓的协同作用和微生物代谢方式，并可能发现一些对食品工业生产有益的微生物课题研究内容:1、对酱香型大曲中蛋白酶产生菌进行分离鉴定

2、：利用稀释平板法和平皿生化反应，对大曲中产蛋白酶微生物进行分离，并对其进行纯化，然后观察其个体形态、群体形态、生长形态。2、蛋白酶的分离纯化：以分离的蛋白酶产生菌为出发菌株，制备菌株蛋白酶粗酶液，测定其酶活力，采用20%～70%不同饱和度(NH4)2SO4对其进行分段沉淀及纯化。3、蛋白酶的酶学性质研究：分别研究菌株蛋白酶的最适作用温度及热稳定性，最适pH及pH稳定性。研究方法和研究思路菌株的鉴定↓蛋白酶的分离纯化↓酶学性质研究菌株的分离：目的菌株的分离及初筛预期研究结果：右图为培养菌株使用的是干扰素培养基，因为产蛋白酶菌株产生的蛋白酶能在培养基上发生平皿生化反应，故产生透明圈，根据透明圈直径

3、大小（D）和菌落直径大小（d）可以初步判断出，该菌株产蛋白酶活力的大小。由表1-1可以初步得出：2#菌株所产生的透明圈直径比最大，故2#菌株为产蛋白酶能力最大的一株。菌株透明圈直径（D）菌落直径（d）比值114.754.783.08216.855.123.29317.325.832.97菌落呈白色，褶皱，边缘不整齐该菌株为革兰氏阳性菌，个体状态为杆状初步判定分离菌株为杆菌属菌落生长形态特征菌株的个体形态特征目的菌株的复筛：取3个250mL锥形瓶，洗净，分别装入液体发酵培养基。然后用8层纱布封口，牛皮纸包扎，放入灭菌锅内，121℃灭菌20min。以5×106个/mL的接种量接种1mL到各个锥形瓶

4、中，然后将锥形瓶放入37℃，恒温摇床培养48h。样品蛋白酶活力测定：预热→反应→中止反应→离心→加液显色↓保温显色↓空白对照目的菌株的蛋白酶活力结果预测：将分离纯化得到的3株蛋白酶产生菌菌株进行蛋白酶活力测定，结果见表菌株酶活力/(U·g)148.2262.1342.4由表可知，2#菌株的酶活力达到最高为什么采用盐析以及盐析方法:盐析法的优点是在常温沉淀过程中不会造成酶的失活，沉淀物在室温下长时间放置也不容易失活。(NH4)2SO4是较为常用的盐析剂，溶解的温度系数小，低温度下其溶解度较高，浓度高时也不容易引起蛋白质生物活性的丧失。盐析结果预测:由图2-3可见，(NH4)2S04沉淀蛋白酶的饱

5、和度应为70%.酶学性质研究:不同的蛋白酶有不同的最适pH、不同的pH稳定性、不同的最适作用温度、不同的热稳定性。蛋白酶最适作用pH及pH稳定性:由上图可知，在pH5至7的范围内，随着pH不断增加，酶活力不断变大；当pH为7.0时，酶活力最大，且为50.43U·g-1；随着pH继续增加，酶活力开始不断下降；可见酶最适作用pH为7.0。酶最适作用pH测定:pH的稳定性:由上图可知，在有底物的情况下，pH为7.0时达到最高，值为39.17U·g-1；不管pH降低或是升高，酶活力都是减小，pH为5.0时，酶活力最小，值为16.65U·g-1，且为最高酶活的42.5%；故得出蛋白酶在pH7.0时最稳定

6、。蛋白酶最适作用温度及热稳定性结果预测：酶最适作用温度的测定：由上图可知，30℃后酶活力不断增加，到50℃时达到最大值50.85U·g-1，50℃后酶活力又不断减小，故酶最适作用温度为50℃。酶的热稳定性由上图可知，无底物存在的情况时，酶保温1h，蛋白酶酶活力从30℃的34.18U·g-1力一直降到80℃的4.76U·g-1，故蛋白酶酶活随温度的升高而降低，到50℃后酶活下降较快，温度在30℃~50℃较为稳定。由此可知随着温度的升高，酶的热稳定性越差。谢谢观赏！