mir-21体外转染神经元方案优化及其在体外tbi模型中神经保护作用的机制研究

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1、分类号：R651.1学校代码：10062密级：学号：2012602753硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：miR-21体外转染神经元方案优化及其在体外TBI模型中神经保护作用的机制研究TITLEThe1optimal1protocol1of1miR-21transfectedintoneuronsandthemechanismofneuroprotectiveeffectintheexperimentaltraumaticbraininjuryinvitro一级学科：临床医学二级学科：外科

2、学神经外论文作者：韩召利指导教师：雷平教授天津医科大学研究生院二零一五年五月分类号：R651.1学校代码：10062密级：学号：2012602753硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：miR-21体外转染神经元方案优化及其在体外TBI模型中神经保护作用的机制研究TITLEThe1optimal1protocol1of1miR-21transfectedintoneuronsandthemechanismofneuroprotectiveeffectintheexperimentaltraum

3、aticbraininjuryinvitro一级学科：临床医学二级学科：外科学神经外科学论文作者：韩召利指导教师：雷平教授天津医科大学研究生院二零一五年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学

4、有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密√。（请在相对应的方框内打“√”）学位论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日天津医科大学硕士学位论文中文摘要目的：本研究首先通过在不同转染条件下，包括不同的转染溶剂、预处理和转染试剂浓度，对miR-21在神经元内表达水平和神经元损伤的检测，建立一种稳定、高效，

5、并且对神经元损伤较小的转染方案。进一步通过转染体外神经元，并通过TBI模型来检测miR-21在TBI过程中是否发挥抗凋亡作用并探索其可能的作用机制，为进一步的研究和颅脑创伤的临床基因治疗提供理论依据方法：神经元取自24小时的Wistar乳鼠，培养7天。标记FAM的miR-21Agomior用于检测miR-21是否可以转染进入神经元。神经元随机分为5组：饥饿-DMEM（S-DMEM）组、非饥饿-DMEM（N-DMEM）组、饥饿-Neurobasal（S-Neurobasal）组和非饥饿-Neurobasal（N-Neu

6、robasal）组和空白对照组（Sham）。miR-21oligomers（20μM，2.5μl）与RNAiMAX(0.5/1/1.5/2/2.5μl)融合后，加入DMEM或Neurobasal-A使转染液达到500μl或250μl。饥饿组在转染前，仅加入250μlDMEM或Neurobasal行饥饿1小时。然后将转染液加入各组的到6孔板中转染6小时，继续培养48小时进行下一步的试验分析。miR-21在神经元内的表达通过RT-PCR及miR-21靶基因PTEN和PDCD4的表达情况来检测。同时为了避免miR-21的生

7、物学作用对神经元损伤的影响，将miR-21agomir更换为miR-21negativecontrol后，进行转染后，通过TUNEL凋亡试剂盒和MTT试验检测神经元损伤情况。按照上述转染方案，将FAM标记的miR-21agomir用于检测miR-21的转染效率。然后将细胞随机分为5组：空白组，TBI组，TBI+miR-21agomir(TBI-A)组,TBI+miR-21antagomir(TBI-AN)组和TBI+miR-21negativecontrol(TBI-NC)组。miR-21agomir,miR-21a

8、ntagomir和miR-21negativecontrol按相应组进行转染；转染后48小时，除空白组外，分别进行划痕损伤。划痕损伤后24小时，各组神经元内miR-21和PTEN表示水平通过RT-PCT检测；各组神经元的凋亡情况通过TUNEL和MAP-2荧光双染检测。WesternBlot检测PTEN、总AKT、p-AKT，以及其下游凋亡相关蛋