人参皂苷对体外培养低氧海马神经元的保护作用论文

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1、人参皂苷对体外培养低氧海马神经元的保护作用论文王双燕王守彪沈若武李安庆杨学伟【关键词】人参［摘要］目的观察人参皂苷（Rg2）对大鼠低氧海马神经元的保护作用及其机制。方法取新生EM、马血清购自Gibco公司；胎牛血清由杭州四季青生物材料工程公司生产；多聚赖氨酸为Sigma公司产品。1.1.3主要仪器设备及来源OLYMPUS，BX50，PM20系统显微镜（日本）；PM6OLYMPUS解剖显微镜（日本）；二氧化碳细胞培养箱（上海福玛实验设备有限公司）；超净工作台（YJ型，苏州市洁净技术研究所）。1.2方法1.2.1海马神经元的培养采用文献［5］的细胞培养方法。取新生1~3d的）15μL（终浓度

2、为5μmol/L），经37℃恒温水浴振荡孵育30min，以1000r/min离心10min后，弃去上清，加入羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）溶液2mL，吹打沉淀制成悬液。重复上述步骤，最后制成2mL重悬液，荧光分光光度计测500nm处的发射波长，300~400nm激发波长测定吸光度(A)。并按文献［7］所提供的公式计算Ca2+含量(［Ca2+］i)。1.3统计学处理应用CS2000软件对实验结果先进行方差齐性检验，若方差不齐，则先行数据转换或用秩和检验；若方差齐，则进行F检验。2结果2.1细胞存活率的计算分离出的海马细胞在接种之前，制备109/L细胞悬液，用2g/L台盼蓝染色，显微镜下观察

3、，死亡细胞呈蓝色，活细胞不着色，细胞存活率为97%。2.2神经元的鉴定经尼氏染色，光学显微镜下观察，可见海马神经元胞质染蓝色，胞核无着色，表现为空泡状核的典型特征。2.3细胞形态光学显微镜下，可见对照组大部分细胞核固缩、边集或破碎，染色变深，细胞膜皱褶、卷曲、出泡。尼莫地平组少量的细胞核固缩、边集或碎裂。Rg21组仍有一部分细胞核固缩、边集、破裂，但数量已经很少。Rg22组的大部分细胞核染成蓝紫色，胞浆淡粉色。每组随机选择10个视野，计算细胞死亡率，对照组细胞死亡率明显高于Rg21、2组，以Rg22组最低，差异有显著性（χ2=3.37，P0.05），见表1。2.4各组海马神经元内［Ca2

4、+］i比较对照组细胞内［Ca2+］i最高，尼莫地平组细胞内［Ca2+］i仅次于对照组，且均明显高于Rg21、2组，以Rg22组最低，差异有显著性（F＝466.58,q=6.76~48.82，P0.01）。见表1。表1Rg2对低氧损伤海马神经元细胞死亡率以及［Ca2+］i的影响（略）3讨论海马是脑内对缺血、低氧最为敏感的部位之一。本实验采用新生大鼠海马神经元培养，建立低氧损伤细胞模型，通过加入阿糖胞苷，可有效地抑制胶质细胞的生长，保证神经元的纯度，经台盼蓝染色检查，细胞存活率达97％，符合细胞培养实验的要求。在脑低氧损伤机制的研究中，目前最受重视的是兴奋性氨基酸毒性作用及胞内钙超载学说。低

5、氧引起突触前兴奋性氨基酸大量释放，过度激活突触后电压依赖性NMDA受体门控通道，引起细胞外Ca2+大量内流，导致细胞内Ca2+超载，干扰线粒体的氧化磷酸化过程；细胞浆Ca2+浓度升高被认为是凋亡的第二信使，它可以激活某些蛋白酶、内源性核酸酶和磷脂酶，这些酶的激活使细胞核结构受到破坏，从而造成神经元损伤。因此，细胞内Ca2+超载被认为是神经元低氧损伤的最后通路［8］。有研究表明，神经元凋亡产生的可能机制与Ca2+超载有关，细胞内Ca2+浓度升高是细胞凋亡的始动因素，反之，如能阻止细胞内Ca2+浓度升高，则能减慢和抑制细胞凋亡［9］。本实验结果表明，低氧造成细胞凋亡，引起Ca2+内流，细胞内

6、Ca2+超载；而尼莫地平和Rg2可以减少Ca2+内流，抑制细胞凋亡，以0.050mmol/LRg2组作用最为明显。由于Fura2/AM与胞浆中的Ca2+有很高的亲和力，两者以1∶1结合形成Fura2Ca2+复合物。这一复合物的激发光谱高峰分别为380nm和340nm，且其发射光的荧光比值变化与Ca2+浓度成比例关系。因此，Ca2+浓度在10-3~10-5μmol/L时荧光发射强度与Ca2+浓度之间存在一定的函数关系［7］。本实验结果显示，对照组Ca2+浓度明显高于其他3组。由此可见，低氧损伤了神经元，导致细胞内Ca2+超载，细胞内Ca2+显著增加。而Rg2可抑制Ca2+内流，有效地降低细

7、胞内Ca2+含量。提示，Rg2可能通过抑制Ca2+内流来保护神经细胞抗低氧的损伤。［