钙调蛋白神经保护作用的体外研究

《钙调蛋白神经保护作用的体外研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、钙调蛋白神经保护作用的体外研究刘宝莲(山东省蒙阴县人民医院药剂科，山东蒙阴276200)目的探讨钙调蛋白Calmodulin(CaM＞神经保护的作用及相关机制。方法0.32mM异氟烷处理培养一周后的祌经细胞12h,异氟烷处理前提前两天在培养基中加入钙调蛋白,将细胞随机分为溶剂对照组(control组)、异氟烷处理组(iso组)和异氟烷加钙调蛋白组(iso+CaM组)，检测细胞的MTT，对细胞进行Hoechst33258焚光炎色观察凋亡细胞并计数。结果control组的MTT值明品高于iso组和iso+CaM组(P<0.05),凋亡细胞计数明显低于iso组和is

2、o+CaM组(P<0.05)；iso组MTT值明显高于iso+CaM(P<0.05),凋亡细胞计数明显低于iso+CaM(P<0.05)o结论0.96mM的异氟烷处理2h对小鼠的祌经元产牛.了明显的毒性；钙调蛋白能明显减轻异氟烷的神经毒性。关键词：钙调蛋白；异氟烷；原代培养；神经元中国图书资料分类号文献标识码钙调蛋白Calmodulin(CaM)是细胞内一种主要的Ca2+受体信号系统调控蛋白，CaM能够激活钙调蛋白依赖性的PDE、钙神经素、钙调蛋白激酶CaM-Kinase(CaMKs)o目前的研究发现钙调蛋白能够介导脑中CaMKs磷酸化并调节大量的

3、蛋白底物，CaMKs在脑中含量极为丰富，CaMKs能调节神经递质的释放，对神经系统中突触的形成和神经行为等方面有重要作用1。近年来的许多研宄发现了吸入麻醉药异氟烷的祌经毒性作用，特别是其对发育中的动物祌经系统的影响2。木实验采用神经细胞体外培养的方法，从细胞水平探讨给予CaM后对异氟烷神经毒性的影响，从而进一步确定CaM对神经细胞的保护作用。材料与方法一、材料SPF级孕16-17天的昆明小鼠，由第四军医大学实验动物中心提供。胎牛血清(杭州四季青)；Neurobasal培养基(美国Introgen);0.25%胰酶、L-多聚赖氨酸、B27、双抗、MTT、DMSO、Ho

4、echst33258染色液（美国Sigma）;异氟烷（美国Baxter）;其他试剂均为进U或市售分析纯;C02培养箱（美国Revco）;二氧化碳培养箱（美国SHELL/JB）；XDS一IB倒置显微镜（重庆光电仪器冇限公司）；EIxSOO酶标仪（德国Bio2tek仪器公司）。二、细胞分组分为:①对照组；②异氟烷0.96mM组；③异氟烷0.96mM+CaM5uM组；三、小鼠大脑皮层神经元分离、培养参考文献3的方法并做适当改进：选用怀孕16-17天的昆明小鼠，常规消毒后无菌条件下颈椎脱闩处死断头取脑，在预冷的D-Hanks液中解剖分离大脑皮层，解剖显微镜下去除脑膜和血管，

5、D—Hanks液洗2〜3次，剪成lmm×lmm×lmm左右的小块，0.25%胰蛋白酶37°C消化20min，取出吹打，并用含10%胎牛血清的DMEM培养基终止反应。1000r/min离心5min,弃上清液，用D—Hanks液洗1次，再离心，弃上清液，用含10%胎牛血清的DMEM培养基调节细胞悬液浓度为5×105/ml,接种于经0.01%多聚赖氨酸包被过夜的培养板中，放入37C恒温的CO2培养箱内（95%空气和5%CO2,湿度85%〜98%）培养。48h后全量换液。以后根据培养基颜色变化，每2〜3d半量换液1次。细胞培养至7d，经神

6、经元特异性烯醇化酶（NSE）免疫细胞化学法鉴定，神经元占全部细胞总数的80%以上，仅少数细胞是星型细胞和其它胶质细胞。取培养7d的神经细胞进行实验。四、异氟烷溶液的配制用改良的Blanck和Thompson法配制可溶解于培养基的异氟烷溶液.10mM的异氟烷溶液的配制方法：将130μL液体异氟烷（l-chloro-2,2,2-trifluoroethyldifluoromethylether;AbbottLaboratoriesInc.,ChicagoIL）加入103mLBSS中，100-mL容积的棕色容量瓶盛装。玻璃瓶塞封口防止气体扩散。配好的溶液在摇床上摇匀

7、24h以充分溶解异氟烷。使用前迅速将30mL溶液倒入50mL聚丙烯离心管中，震荡5-lOs制成日常储备液。用BSS将日常储备液稀释0.96mM来处理细胞。在以往的研究中，异氟烷在溶液中的稳定性取决于处理的样品（相同条件下处理30min）。用气相色谱技术证实异氟烷的浓度4。五、四甲基偶氮哇盐（methylthiazolyltetra—zolium，MTT）检测细胞活力活细胞线粒体中的琥珀酰脱氢酶具有将MTT中的四氮唑环还原成一种蓝紫色的化合物（甲躜）的能力，甲躜的量与活细胞数成正比。在上述损伤结束吋，加入MTT（终浓度为0.5mg/mL）,置C02孵箱中继续培养4