转染Noggin基因的骨髓基质干细胞体外分化为神经元样细胞的研究

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1、转染Noggin基因的骨髓基质干细胞体外分化为神经元样细胞的研究作者：孙弦周盛年张明丽魏先森刘黎青【摘要】目的构建Noggin基因的表达载体,分离骨髓基质干细胞、胶质细胞神经营养因子等〔1～3〕,诱导分化为神经细胞，这为解决神经损伤的临床治疗提供了更为广阔的前景。但是利用胚胎发育过程中的神经诱导蛋白对骨髓基质细胞诱导分化的研究尚属空白。Noggin在神经前体细胞的增殖和神经发生、发展过程中发挥重要作用。因此，我们设想利用Noggin基因诱导BMSCs在体外分化为神经元样细胞,并为进一步探讨神经发育机制的体外研究打下基础。1材料与方法动物由山东大学实验动物中心提供雄性2～3月龄Wistar大鼠,

2、体重(200±10)g。试剂与材料基因表达载体构建:根据人Noggin基因cDNA的全部序列,设计Noggin基因上游引物为5′CATAAGCTTGCGTGGTTGCATCAC3′,下游引物为5′GGTCTAGATTACTGCACGACGAC23′(由上海生工生物有限公司合成)；载体pMD18simpleT为一种高效克隆PCR产物的专用载体,购自大连宝生物有限公司；真核表达载体质粒pCS+〔Tα1〕GFP由KennedyKrieger研究所NicholasMarshArmstrong教授惠赠。Trizol试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒、凝胶回收试剂盒购自上海生物工程公司。限制性内

3、切酶HindⅢ、XbaⅠ,T4DNA连接酶、DNAMarkerDLXX均购自大连宝生物有限公司。质粒小量提取试剂盒购自Promega公司;脂质体XX、B27购自Invitrogen公司。DMEM/F12培养基购自Gibco公司;胎牛血清购自Hyclone公司,Percoll淋巴细胞分离液系AmershamBioscience公司。MAP2、NSE、GFAP抗体购自美国NeoMarker公司。SABC免疫细胞化学试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物技术公司。TRITC标记的兔抗山羊IgG购自中杉生物技术公司。RNA提取试剂盒、PCR扩增试剂盒购自大连宝生物有限公司。所用引物根据其Gen

4、Bank序列自行设计，由上海英俊生物技术有限公司合成。方法Noggin基因表达载体构建取100mg人胚胎脑组织,按照试剂盒说明取PCR反应产物与pMD1simpleT载体进行连接反应,将连接产物转化到DH5α感受态细胞中，挑取数个菌落,用HindⅢ和XbaⅠ进行双酶切鉴定。将新构建的pMD18Noggin载体、pCS+〔Tα1〕GFP载体应用HindⅢ和XbaⅠ进行双酶切,回收连接载体和目的基因,TDNA连接酶将其连接。在酶切鉴定后,送上海博亚公司测序。大鼠BMSCs的分离培养脱颈处死大鼠后，在无菌条件下分离大鼠的股骨和胫骨,暴露骨髓腔,用培养液冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞液,轻轻叠加到密度为

5、的Percoll淋巴细胞分离液上,000r/min离心20min,吸取单核细胞层,PBS洗2遍,按2×106的细胞密度将细胞接种到含有20%胎牛血清培养液的培养瓶中,置37℃、5%CO2饱和湿度的细胞孵箱中培养。细胞融合后,胰酶消化传代,倒置显微镜下观察细胞生长情况。脂质体转染按照说明书进行。在转染前1天按照1×104/ml接种到24孔板内。转染前随机分组如下：试验组：转染质粒pCS2+〔Tα1〕Noggin；空质粒对照组：混合物中不含有质粒；空白对照组：不加任何操作。用无血清的DMEM/F12培养液稀释质粒和脂质体,将二者轻轻混匀,室温下孵育20min后加到培养孔中。h后换成细胞分化培养液

6、。分化细胞形态学变化细胞转染质粒后在显微镜下观察细胞形态变化。以胞体圆形或锥形,折光性增强,突起形成的细胞记为神经元样细胞。特异性标记物检测取长有细胞的盖玻片，用4%多聚甲醛固定1min，3%H2O2封闭10min，5%BSA封闭10min，分别加入抗鼠NSE、MAP2多克隆抗体，4℃过夜。避光进行以下操作：分别加入TRITC标记的兔抗山羊IgG，37℃孵育40min，用荧光封片剂封片，在荧光显微镜(NikonE600，日本)下观察结果。计算阳性细胞百分比。RTPCR检测神经细胞标记物mRNA表达提取细胞总RNA，以Oligo(dT)1为引物，用AMV逆转录酶于42℃逆转录为cDNA。以c

7、DNA为模板用于PCR扩增目的基因，βactin基因做内对照。所用引物根据其GenBank上所查序列自行设计(表1)。用PCR仪扩增各基因片段，循环条件为：℃预变性min，9℃变性40s，5℃退火40s，7℃延伸1min，共30个循环；最后7℃延伸min。2%琼脂糖凝胶电泳，BIOPRINT凝胶成像系统记录结果，全自动图像分析系统计算各目的基因与βactin条带光密度值。RTPCR检测过程