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1、Noggin基因诱导骨髓基质干细胞 分化为神经细胞的相关研究周盛年山东大学齐鲁医院关键词:1骨髓基质干细胞2Noggin基因3诱导立项依据在骨髓中存在两大类干细胞：造血干细胞骨髓基质干细胞1.造血干细胞可以增殖并分化为其他血液细胞，能够重建宿主的血液系统.通过限制性分化过程，使其子代细胞逐渐成熟，产生红细胞、血小板、单核细胞、粒细胞等成熟细胞，不断补充血液细胞.一般认为在人体内CD34阳性细胞、鼠内为Sca1阳性细胞富含HSC。骨髓基质干细胞（bonemarrowstromalcells,BMSCs)又称骨髓间充质干细胞（mesenchymals
2、temcell，MSCs）即是指骨髓基质系统中所含有的一类多能干细胞，它不表达造血细胞的相关标志，具有向多种中胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化的能力。骨髓基质干细胞特性1.具有自我更新的能力和多向分化潜能，处在不同的微环境中能分化成多个细胞系,形成多种间充质细胞,包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞等,特别是能够横向分化为神经细胞和胶质细胞。2.BMSCs具有易于获得、培养、增殖,多次传代后仍保持干细胞特性并能定向分化为所需细胞,移植后内能长期存活,诱发的免疫反应较弱等特点,并且可以促进胚胎干细胞和神经干细胞增殖和分化,在神经损伤修复、基
3、因治疗、造血重建等实验和临床研究中皆具有良好的应用前景。骨髓基质干细胞特性3.BMSCs在体外可以大量扩增、自体移植可以避免免疫排斥反应和具有强大的可塑性.4.可作为多种疾病细胞替代治疗和基因治疗的载体,使BMSCs成为当今生命科学领域研究的热点之骨髓基质干细胞特性NogginNoggin基因是1992年California大学的Harland,R.M.和Smith,W.C.从非洲蟾蜍的胚胎中分离出来的。此后发现该基因在胚胎发育中有重要神经诱导作用，尤其是诱导外胚层的背侧发育；亦表达于出生后及成年哺乳动物中枢神经系统内，调控成年海马、室下区神经干
4、细胞的增殖和分化，在学习和记忆的形成过程中有重要的作用Nogginnoggin基因是目前在体内与体外均被证实有神经诱导作用的神经诱导剂。其神经诱导功能主要是通过拮抗骨形成蛋白（bonemorphogeneticprotein-4,BMP4）的作用实现的。BMP可促进胶质细胞的分化而抑制神经发生，而noggin蛋白则促进神经发生诱导因骨髓基质干细胞有良好的可塑性，在外界诱导因子刺激下可分化为各类神经细胞。目前一般有三种方法可以诱导分化BMSCs为神经细胞－抗氧化剂、生长因子和转基因诱导。在转基因诱导法中我们引入了Noggin基因――神经诱导基因。课
5、题思路我们构建带有Noggin基因的载体，并将它转染到BMSCs中，预期它能够诱导BMSCs分化为神经细胞，并对分化后的神经元样细胞进行检测。在细胞形态、分子、基因、电生理水平均可证实为神经细胞1.骨髓基质干细胞培养用Percoll淋巴细胞分离液分离出大鼠骨髓基质干细胞，并用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养，胰酶消化传代，扩增大鼠骨髓基质细胞。显微镜下观察形态BMSCs细胞多为梭形、星形,核椭圆。细胞培养至集落间相互汇合时,传代培养, 3代以后细胞均一性好,成漩涡状生长。2.扩增带有Noggin基因的表达载体将构建好的带有目的基因No
6、ggin的质粒转化感受态大肠杆菌株DH5α，挑菌落提取质粒后进行重组体测序鉴定。经酶切、PCR鉴定。3.将带有Noggin基因的表达载体导入骨髓基质细胞内诱导其为神经细胞取第四代、第六代BMSC，用脂质体转染法介导Noggin基因进入到骨髓基质细胞内。观察细胞形态的改变。形态学观察4.检测与鉴定1.利用免疫细胞化学技术鉴定分化细胞是否表达神经细胞特异性标记;2.利用RT-PCR技术检测部分参与神经细胞生理功能的基因.3.利用膜片钳技术检测诱导后的神经细胞是否具有电生理功能。1).免疫细胞化学技术转染后细胞NSE阳性（×100）转染后细胞MAP-2
7、阳性（×100）免疫荧光转然后细胞NSE染色转然后细胞MAP-2染色2)RT-PCR空白对照组空质粒对照组Noggin诱导组Marker自上而下依次是100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，2000;基因排列顺序及大小为NCAM--295,GFAP--792,β-actin--314，SYN-1—577,GAP-43--229,NOGGIN—7603)膜片钳技术原理：膜片钳技术是以微弱电流信号测量为基础的，利用玻璃微电极与细胞膜封接，可测量多种膜通道电流，是一种典型的低噪声测量技术，可以说达到当今电子测量
8、的极限操作步骤1微电极的制备拉制电极优化处理电极充灌2全细胞跨膜总电流的记录施加正压电极入水高阻封接破膜预期结果应用膜片钳技术对骨髓基质
