骨髓基质干细胞向神经细胞诱导分化及体内移植治疗脑缺血的实验研究

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1、骨髓基质千细胞向神经细胞诱导分化及体内移植治疗脑缺血的实验研究目的神经干细胞的发现及其分离鉴定、培养技术的建立，使神经细胞不可再生的传统理论面临巨大挑战，并为神经系统疾病的治疗提供了新的思路。但神经干细胞数量少、分布分散，体外培养时取材困难，无免疫原性神经干细胞系建立困难，以及异体移植的种属差异和社会学、伦理学等方面的问题都极大地限制了神经于细胞的应用。成体动物的骨髓中存在一定数量的骨髓基质干细胞(MScs)，骨髓基质干细胞在适当条件下可以向神经干细胞、神经元、和神经胶质细胞方向分化。MsCs诱导分化为神经元样细胞的研究工作已有一定突破，但诱导形成的神经元样细胞存在着存活时间不长，2

2、4小时后大多死亡的问题。故如何延长MScs源性的神经元样细胞的寿命是极为重要的。另一方面MSCs移植治疗缺血性脑损伤虽己取得一定的进展，但MScs移植后在体内环境下分化为神经胶质细胞的比率较大而分化为神经细胞的比率较小，所以如将骨髓基质干细胞在体外分化为神经元样细胞，再行细胞移植将会有事半功倍的效果。本实验应用体外细胞培养技术将大鼠骨髓基质干细胞分离培养和纯化，测定MSCs的细胞活力、生长曲线和贴壁率，用形态学方法鉴定培养的骨髓基质干细胞。将培养成功的骨髓基质干细胞在体外传代、扩增，以得到一定数量的细胞。以褪黑素(MT)和碱性成纤维细胞生长因子(bH灌)予以干预，以期延长诱导的神经元

3、样细胞的存活时间，并应用生存时间较长的MScs源性神经元样细胞，对局灶性脑缺血大鼠模型(McAO)进行细胞移植。观察植入细胞的分布及存活情况，并探讨细胞植入后对MCAO大鼠脑神经元c—myc、Erk蛋白及其mRNA表达的影响。材料和方法(一)大鼠骨髓基质千细胞的分离培养、扩增纯化l-大鼠骨髓基质干细胞的分离：应用贴壁法结合密度离心法分离大鼠骨髓基质干细胞。2．大鼠骨髓基质干细胞的扩增纯化：建立大鼠骨髓基质干细胞扩增纯化体系，为实验提供种子细胞。3．台盼蓝染色测定细胞活力。4．骨髓基质细胞贴壁率检测。5．骨髓基质干细胞的鉴定：应用免疫荧光法鉴定培养细胞的体表标记，cD45、cD90。应

4、用免疫细胞化学法鉴定培养细胞的体表标记，cD34、CD4J4。(二)大鼠骨髓基质于细胞向神经细胞诱导分化的研究1．MSCs的培养和纯化。2，MSCs向神经细胞的定向诱导分化：应用’MT、bFGF诱导体外培养的大鼠骨髓基质千细胞向神经细胞分化。3．诱导细胞的免疫荧光法鉴定：免疫荧光法鉴定分化细胞NSE、GFAP的表达。(三)大鼠骨髓基质干细胞分化后移植、治疗局灶性脑缺血大鼠的实验研究1．大鼠骨髓基质干细胞的分离培养、扩增。2．体外MSCs向神经元样细胞诱导分化，分化后细胞在体外以Brdu进行标记。3．大鼠脑局灶性缺血模型(MCA0)的制作及神经功能评分。4．大鼠MSCs源神经元样细胞经

5、颈动脉注入McAO模型。5．Brdu标记细胞的免疫组化染色：观察植入细胞的成活率。6．免疫组化染色法测定大鼠脑内c—myc、Erk，原位杂交法测定c—myc、ErkInRNA。观察细胞植入对上述指标的影响。·2·结果(一)大鼠骨髓基质干细胞的分离培养、扩增纯化1．接种l周后细胞集落迅速增多，随着集落不断扩大，互相融合，10—12天细胞贴满培养瓶底，细胞以梭形和园形为主。2．传代培养后的细胞不再以成集落方式生长，生长速度比原代要快。3．P1、P3、P5代MsCs三代细胞在各时间点的贴壁率无显著性差异。4．传代大鼠Mscs潜伏期为1—2天，从第3天起细胞大量增殖进入对数生长期，第6天达到

6、高峰期，以后进入平台期。5．MSCs表达CD90、CD44丽不表达造血细胞的表面标志CD34、CD45。(二)大鼠骨髓基质干细胞向神经细胞诱导分化的研究1．加入含MT、bFGF的培养液后，3天后见部分细胞胞体收缩，折光性增强，伸出突起，部分细胞胞体收缩成三角形，并有些成为简单的双极细胞或多极细胞。2．诱导72小时细胞开始表达NSE，9一14天阳性细胞增多，以MT+bFGF组变化显著，而不表达GFAP。3．诱导分化前Erk蛋白在MScs胞浆中只有微弱的表达，而在诱导的3天后Erk阳性细胞大量出现。(三)大鼠骨髓基质干细胞分化后移植、治疗局灶性脑缺血大鼠的实验研究1．MCAO大鼠细胞植入

7、后神经功能评分较对照组明显改善。2．细胞植入组大鼠脑内48小时在损伤侧脑中见散在BrdU阳性细胞，7天后BrdU阳性细胞逐渐增多，14天时阳性细胞数不再增多。3．MCA0大鼠在细胞植入48小时内，在基底节、皮层、海马区神经细胞均可见C—mycmRNA阳性细胞。4．MCA0大鼠脑中Erk蛋白、Erkm—RNA阳性细胞在细胞植入24～48小时增多。l周后Erk蛋白阳性细胞仍保持在较高比例。论1．密度梯度离心法与贴壁培养法相结合是分离骨髓基质干细胞简便·3·高效