转染noggin基因的骨髓基质干细胞体外分化为神经元样细胞的研究

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1、转染Noggin基因的骨髓基质干细胞体外分化为神经元样细胞的研究作者：孙弦周盛年张明丽魏先森刘黎青【摘要】目的构建Noggin基因的表达载体,分离骨髓基质干细胞（BMSCs)，探讨转染Noggin基因的BMSCs在体外分化为神经元样细胞的情况。方法应用RTPCR技术扩增Noggin基因,利用基因工程技术构建载体pCS2+〔Tα1〕Noggin，分离、培养大鼠BMSCs，借助脂质体将Noggin基因转入BMSCs。观察诱导后细胞形态变化,利用免疫细胞化学方法鉴定分化细胞是否表达神经细胞特异性烯醇化酶

2、(NSE)、微管相关蛋白2(MAP2)以及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。利用RTPCR方法检测神经细胞标记物mRNA的表达。结果成功构建Noggin基因的真核表达载体并分离培养BMSCs。转染Noggin基因表达载体后,分化的BMSCs形态似神经细胞；免疫化学检测到NSE、MAP2特异性标志物表达,未检测到GFAP表达；RTPCR测得神经细胞标记物GAP43、NCAM、SYN1表达。结论从形态、蛋白、基因水平证实转染Noggin基因的BMSCs在体外可以分化为具有部分功能的神经细胞。【关键词

3、】骨髓基质干细胞;基因转染;Noggin;分化;神经细胞【Abstract】ObjectiveToconstructanexpressionvectorofNogginandisolatebonemarroesenchymalstemcells(BMSCs),toexplorethedifferentiationofBMSCstransfectedplifiedbyRTPCR,andthenee.ThechangesofcellshapeicrotubuleassociatedprotEin(MA

4、P2)andglialfibrillaryacidicprotEIn(GFAP)ofdifferentiationcellmunocytochemistry,andneurocytemarkermRNAeasuredbyRTPCR.ResultsTherebinantpCS2+〔Tα1〕Nogginplasmidorphologies.ItedthatthedifferentiatedcellsexpressedNSE,MAP2butnoGFAPbyimmunocytochemistryand

5、neuralfunctionalgenesNCAM,GAP43,SYN1butnoGFAPbyRTPCR.ConclusionsTheBMSCstransfectededinmorphology,proteinandgeneaspects.【Keyarroesenchymalstemcells;Genetransfection;Noggin;Differentiation;Neurocyte目前临床治疗手段对于已死亡的神经细胞无再生的方法。目前研究报道BMSCs在体内外可以被化学物质如视黄酸、β巯

6、基乙醇，中药如黄芩甙、天麻，营养因子脑源性神经生长因子（BDNGF）、胶质细胞神经营养因子等〔1～3〕,诱导分化为神经细胞，这为解决神经损伤的临床治疗提供了更为广阔的前景。但是利用胚胎发育过程中的神经诱导蛋白（Noggin）对骨髓基质细胞诱导分化的研究尚属空白。Noggin在神经前体细胞的增殖和神经发生、发展过程中发挥重要作用。因此，我们设想利用Noggin基因诱导BMSCs在体外分化为神经元样细胞,并为进一步探讨神经发育机制的体外研究打下基础。1材料与方法1.1动物由山东大学实验动物中心提供雄性2～

7、3月龄D18simpleT为一种高效克隆PCR产物的专用载体,购自大连宝生物有限公司；真核表达载体质粒pCS2+〔Tα1〕GFP由KennedyKrieger研究所NicholasMarshArmstrong教授惠赠。Trizol试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒、凝胶回收试剂盒购自上海生物工程公司。限制性内切酶HindⅢ、XbaⅠ,T4DNA连接酶、DNAMarkerDL2000均购自大连宝生物有限公司。质粒小量提取试剂盒购自Promega公司;脂质体2000、B27购自Invitrogen公司。

8、DMEM/F12培养基购自Gibco公司;胎牛血清购自Hyclone公司,Percoll淋巴细胞分离液系AmershamBioscience公司。MAP2、NSE、GFAP抗体购自美国NeoMarker公司。SABC免疫细胞化学试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物技术公司。TRITC标记的兔抗山羊IgG购自中杉生物技术公司。RNA提取试剂盒、PCR扩增试剂盒购自大连宝生物有限公司。所用引物根据其GenBank序列自行设计，由上海英俊生物技术有限