smhppr和smras酵母异源表达以及半合成迷迭香酸工程菌的构建

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1、分类号Ｒ２８密级公开学号１２２１２２■、瞧＂圓壓誦湯■硕壬学位论文（学术型）＾成少欠和訊题目奶＾化４Ｓ酵母异源表达及半合成迷迭香酸工程菌的构建作者周宏雜指导教师王詰之教授－级学科名称中药学二级学科名称中药学提交日期二０—五年五月学位论文原创性声明本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行研巧工作所取得的研巧成果。尽我所知，本论文不包含其，除文中已经注明引用的内容和致谢的地方外他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人或他

2、人己申请学位或其他用途使用过的成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。一本学位论文若有不实或者侵犯他人权利的，本人愿意承担切相关的法律责任。作者签名：鼠奈遺日期：乂〇１＾年＾月＾《日学位论文知识产权及使用授权声明书本人在导师指导下所完成的学位论文及相关成果，知识产权归属陕西师范大学、使用学位论文的规定，允许本论文被。本人完全了解陕西师范大学有关保存査阅和借阅，学校有权保留学化论文并向国家有关部口或机构送交论文的纸质版，可＾＾采用和电子版，有

3、权将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进巧检索任何复制手段保存和汇编本论文？本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西姉范大学？保密论文解密后适用本声明。化巧同索教曰親从化年月王曰摘要丹参（姑／ｖＺａｗ術ｏａｔＷｚｃ／Ｂｕｎｅ为唇形科多年生草本植物，是我国沿用已久的ｇ）一一大宗药材之。水溶性的献酸类化合物是丹参的主要药用有效成分之。由于传统中药长期Ｗ来将药物经水煎煮制成汤剂后服用，水溶性成分发挥的功效更多，这也使得该类成分成为近年来研究的热点。其中，迷迭香酸（ｒ

4、ｏｓｍａｒｉｎｉｃａｃｉｄ，ＲＡ）、和下游产物丹酪酸Ｂ（ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃａｃｉｄＢＳａｌＢ都具有抗肿瘤、抗肝损伤和保护屯血，）管等活性。因此，研究丹参迷迭香酸途径可Ｗ更合理的利用其药用资源，并有助于研巧下游酪酸类物质的合成途径。文献报道丹参迷迭香酸合成途径可能与彩叶一。草相似，但具体的生源途径还不完全清楚，还需进步研究该途径上的汉《似王、加供好、疏４ＣＺ、加说蹲酶基因功能已被研究的较为清楚，但目前还没有ＳｍＨＰＰＲ和ＳｍＲＡＳ蛋白活性研究的相关报道。将植物次生代谢途径相关基因整合

5、进微生物中，Ｗ工程菌作为生物反应器，异源发酵生产植物次生代谢产物ＰｌａｎｔｓｅｃｏｎｄａｒｍｅｔａｂｏｌｉｃｒｏｄｕｃｔｓＰＳＭＰｓ的方法ｙｐ，（）己经比较成熟。该方法弥补了传统植物提取和化学合成的不足，不需要大量的植物材料或繁琐的合成步骤，就可Ｗ生产大量具有天然构象的ＰＳＭＰｓ，且成本低、效率高。因此，本研巧旨在通过毕赤酵母（巧ｃＷａｆｃＷｏｎ句异源表达药用植物丹参的关键酶ＳｍＨＰＰ民和ＳｍＲＡＳ，并且检测ＳｍＨＰＰＲ蛋白活化进而在体外对丹参的迷迭香酸代谢通路进行研究。此外，通过基因工程技

6、术构建了讯７饼ｒ、訊７排叩＾？和化４Ｓ兰基因串联共表达的酵母工程菌，Ｗ期为日后在酵母中异源生产迷迭香酸奠定基础。本研巧得到的结论如下：１）从丹参中克隆得到筑７＼加好户尸７？和加化４Ｓ，分别长７１剧的开放阅读框（ＯＲＦ）ｘ１２３６ｂｐ、９４２ｂｐ和１２８４ｂｐ。成功构建了ＳｍＨＰ化融合６扭Ｓ的胞内单表达载体ｐＰＩＣＺＢ－汉ｗｉ／Ｐ尸乂和胞外单表达载体ＰＩＣＺａＡ－汉７７巧中；？，Ｗ及ＳｍＲＡＳ顧合６ｘＨＩＳ的ｐ－Ｐ－胞内单表达载体ｐＩＣＺＢ細化４Ｓ和胞外单表达载体ｐＰＩＣＺａＡ加化４５。

7、２）优化电转化条件，当电转杯间距１ｍｍ、电压７５０Ｖ、单个脉冲０．４ｍｓ、脉２Ｘ－Ｘ冲２５次时，毕赤酵母３３的转化效率最高，转化率为１．５７１０。共得４个空载３ＩＰｉ？重４Ｓ菌株，个訊７排组菌株，４个奶７化重组菌株。本研究中，优化蛋白诱导。条件，ＳｍＨＰＰＲ的最适ｐＨ为６．５，最佳甲醇添加量为０．５％丹参ＳｍＨＰＰ民蛋白条带在７０１＾〇３左右，＾ｉ＾二聚体形式存在。ＳＩｎＲＡＳ蛋白只在ｐＨ７．０表达，诱导时最Ｉ佳甲醇添加量为０．５％。ＳｍＲＡＳ蛋自纯化得到两个条带８０，分别为７０ｋＤａ左右

8、和ｋＤａ左右，推测可能在表达过程中受到了不同程度的糖基化修饰。３）ＨＰＬＣ检测ＳｍＨＰＰＲ酶反应产物，发现反应液中几乎检测不到添加的底物４－４－。轻基苯丙爾酸，但没有检测到预期的产物瓷基苯魏酸推测可能生成新的未知产物或者该蛋白在表达过程中部分未正确折叠，至然能够与底物结合，但未能释放底