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《_淀粉酶和糖化酶的表达及酿酒酵母工程菌的构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、中山大学学报(自然科学版)第38卷第2期ACTASCIENTIARUMNATURALIUMVol138No121999年3月UNIVERSITATISSUNYATSENIMar11999文章编号:052926579(1999)0220080205Xα2淀粉酶和糖化酶的表达及酿酒酵母工程菌的构建11122吴晓萍,李文清,罗进贤,后茂立,林资诚(1.中山大学生命科学学院,广东广州510275;2.广州市微生物研究所,广东广州510250)摘要:将切除了5′端非编码区50碱基对片段的黑曲霉糖化酶GAIcDNA与大麦α2淀粉酶基因重组进大肠杆菌酵母穿梭载体,
2、构建重组表达质粒pMAG11,转化酿酒酵母GRF18,获得含α2淀粉酶和糖化酶双基因的酵母工程菌GRF18(pMAG11).在酵母PGK基因启动子和终止信号的调控下,α2淀粉酶和糖化酶基因获得高效表达,99%的表达产物分泌至胞外.在含w=15%的可溶性淀粉的YPS培养基中培养44h,淀粉水解率达到99%,并能发酵产生酒精.关键词:α2淀粉酶;糖化酶;基因表达;酿酒酵母工程菌;分解淀粉中图分类号:Q55文献标识码:A利用基因工程技术构建能分解和利用淀粉的酵母工程菌可以克服酵母菌由于缺少水解淀粉的酶类,淀粉需先糊化,α2淀粉酶液化,糖化酶糖化的复杂工序,
3、节省能源和酶制剂,降低成本,有重要的应用前景.80年代末以来国外多个实验室先后将α2淀粉酶基因[1～3]和糖化酶基因分别引入酿酒酵母构建能分解淀粉的酵母工程菌,但淀粉水解能力都不高,不能用于生产.本实验室曾将地衣杆菌α2淀粉酶与黑曲霉糖化酶基因同时引入酿酒酵[4,5]母,构建的工程菌在酶的表达和分泌水平及降解淀粉的能力方面都高于国外菌株.本文报道经PCR改造的黑曲霉糖化酶GAIcDNA与大麦α2淀粉酶基因重组于同一表达载体,转化酿酒酵母后获得能高效表达α2淀粉酶和糖化酶和水解淀粉能力很强的酵母工程菌.1材料和方法111材料11111菌株和质粒本实验所
4、用菌株与质粒见表1.11112培养基大肠杆菌E1coli的培养和转化用L2肉汤,酵母的培养用YPD,SC,YPGE,YPS培养基,酵母的转化用SOS,SSTOP及SORB培养基,它们的配方见文[7].11113主要的生化试剂限制酶HindⅢ、EcoRⅠ及T4DNA连接酶为Promega公司产品.低熔点琼脂糖、牛血清蛋白、卵清蛋白购自Sigma公司.蜗牛酶、葡萄糖试剂盒、抗生素等为国产分析纯试剂.X基金项目:广东省自然科学基金资助项目(940628);广州市重点项目基金资助项目收稿日期:1998202220作者简介:吴晓萍,女,1971年生,硕士研究生
5、.第2期吴晓萍等:α2淀粉酶和糖化酶的表达及酿酒酵母工程菌的构建81表1菌株与质粒Tab11Strainsandplasmids菌株/质粒基因型来源-大肠杆菌C600F,thi21,thr21,leuB6,lacY1,tonA21,supE44JacobMonod研究所00酿酒酵母GRF18leu2,his3,sta,ihn暨南大学rpBAL7LEU2,2μori,pBR322ori,Amp,barleyAmy广东省微生物所r1)[6]pMAG17Amp,pBR322ori,LEU2,2μori,GAI本实验室r[5]pMAG15Amp,pBR322
6、ori,LEU2,2μori,GAI,barleyAmy本实验室r1)pMAG11Amp,pBR322ori,LEU2,2μori,GAI,barleyAmy本研究工作1)切除了5′端非编码区的GAIcDNA112方法11211DNA的制备和操作大肠杆菌质粒的制备,DNA的酶解,酶解片段的回收,DNA的连接反应及转化均按文[8]方法.酵母原生质体转化参照文[9]方法.11212淀粉酶阳性菌落的检测和总酶活力测定参照文[9]方法.11213发酵液中残余淀粉含量的测定和重组质粒的稳定性检测参照文[10]的方法.11214发酵液中酒精含量的测定采用简易的酒
7、精定量测定法.先配体积分数为1%,3%,5%,7%及9%的酒精标准液.加3mLK2Cr2O4(w=4%K2Cr2O4溶于5mol/LH2SO4)溶液于6mL刻度试管内,将刻度试管置于加有012mL饱和K2CO3的50mL比色试管内,加015mL酒精标准液于比色试管中,立即盖好盖子,摇匀,于50℃保温5h.取出后在刻度管内加入3mL蒸馏水,摇匀,测A560并以双蒸水代替酒精作对照.以酒精标准液浓度为横坐标,A560为纵坐标绘制标准曲线.测定发酵液中酒精含量时,用015mL发酵液取代酒精标准液,测得A560后,查标准曲线乘以稀释倍数即得发酵液中酒精含量.
8、2结果图1重组质粒pMAG11的构建Fig11Constructionofrecombinantplasmi
