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1、生物工程学报一,翻‘’班’一淀粉酶和糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌罗进贤何鸣李文清张添元中,广州山大学生物工程研究中心。一淀粉酶一摘要将地衣芽抱杆菌基因及黑曲霉糖化酶重组进大肠杆菌酵母穿梭质,,。粒转化酿酒酵母构建能分解淀粉的酵母工程菌酶活力测定和酶学性质分析的结果显示一,一在酵母因子及磷酸甘油酸激酶基因的启动子和终止信号的调控下淀粉酶和糖化酶基因在酵母中获得高表达并向胞外分泌这两种酶。构建的酵母工程菌在含淀粉的培养基中天内能水解的淀粉,重组质粒能在酵母中较稳定地存在。关键词一淀粉酶,糖化酶,基因表达,酿酒酵母一近年来国外多个实验室先后把各种来源的淀粉酶基因和葡
2、萄糖淀粉酶糖化一‘’,。。一酶基因引入酿酒酵母构建能分解淀粉的菌株我们曾将地衣芽抱杆菌淀粉酶基·〔‘,。〔,吕〕,。一因及黑曲霉糖化酶的转入酿酒酵母获得表达和分泌本文报道将淀,,一粉酶基因和糖化酶的重组于同一酵母表达载体转化酿酒酵母利用酵母,一因子及磷酸甘油酸激酶基因的调控序列实现淀粉酶和糖化酶在酿酒酵母中,。同时表达和分泌构建的酵母工程菌能高效分解淀粉材料和方法材料一〔幻。。地衣芽饱杆菌淀粉酶荃因和黑曲霉糖化酶为本课题组克隆获得表菌株和质粒一〔一,飞,乙‘七‘砚艺一,,奋一,一。奋一,,资〔〕‘刀‘七‘“‘,,矛丙妙尸纽一资山〕一‘,,拜,是一】」一‘,,、·
3、,入拜加广东省自然科学基金资助。本文于年月日收到。生物工程学报卷菌株与质粒本研究所用菌株和质粒如表,一是含地衣芽袍杆菌一,淀粉酶基因的大肠杆菌酵母穿梭质粒是含黑曲霉糖化酶的大肠杆菌一酵母穿梭质粒。,培养基大肠杆菌的培养和转化用培养基酵母的培养和原生质体转化用的培养基有、、、、及等培养基,其成分见文献。〔〕、一生化试剂限制酶记皿连接酶为公司产品低融点琼脂糖、、等分别购自公司和公司,其余为国产分析纯试剂。方法〔,‘,,质粒的检测和制备大肠杆菌质粒的检测和制备按的方法酵母质一。飞、粒的检测按的方法川质粒的酶解、酶解片段的回收参照文献〔的的方法。’‘,,分子的连接和大肠
4、杆菌转化按的方法酵母原生质体转化按的方法’〕。淀粉酶阳性菌落的检测和酶活力测定见文献〔〕。一个酶活力单位定义为’,的条件下每小时产生葡萄糖的酶量。淀,粉水解产物的纸层析鉴定取适量的培养上清液与可溶性淀粉混匀在‘’,,,以正丁醇毗咤,一的条件下保温小时在新华号滤纸上点样水,,,上,一,,为展开剂进行纸层析行次用苯胺邻苯二甲酸显色与标准样品比较分析水解产物的成分。·。〔‘〕培养液中剩余淀粉含量的测定和重组质粒的稳定性检测参考的方法结果一。含淀粉酶和糖化酶基因的酵母表达载体的构建。一,为使淀粉酶和糖化酶基因能在酿酒酵母中同时表达将这两个基因重组进同一酵,。。一一,母质
5、粒构建表达载体地衣芽抱杆菌的淀粉酶基因位于质粒上该基因一一二‘〕。。在因子的启动子和信号序列的调控下已在酿酒酵母中表达和分泌如图所,一一示用二班把质粒八〔上的含启动子糖化酶终止序列的的片一段切出低融点玛〔脂糖凝胶电泳分离,然后将此的片段以适当一,比例与经盯酶解的质粒混合用连接酶连接后转化大肠杆菌。在氨节青毒素平板二筛选转化子并经质粒快速检测找出含插入片段的重组子图一〕,是重组质粒及和的皿酶解片段的凝胶电泳图经皿酶切后产生条带,分别为、和其中的带是含糖化酶,,及启动子和终止序列的片段重组质粒经皿酶解后产生两条带大的带一坦,皿与的酶解片段相同小带来自经酶切后产生的片
6、段。这一结果表明,含黑曲毒树化酶的片段已重组进质粒一,将构建的重组质粒命名为。一淀粉酶和糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌用,原生质体转化法将构建的表达载体引入酿酒酵母在缺亮氨期。一罗进贤等淀粉酶和糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌石曰,加,七日坛皿。叫因口刀功,访,图质粒的构建、万·、一、一习记记℃飞一、〔一一记酸的再生培养基上筛选转化子,转点,于缺亮氨酸的淀粉培养基上同时点一,及受体菌作对照,℃培养天,倒碘,液于平板上可见在、及菌落周围都出现淀粉水解后产生的透明圈图,在该平板上不生长,而且形成的透明圈比一及的大,显示前者的酶活较高。为了研究酶的分泌情况,将以上酵母转
7、图重组质粒的酶切分析一。、化子的单菌落接种于含葡萄糖的培八,,养基中振荡培养小时离心收集细入入万,,一,,胞转至不含葡萄糖的培养基中生物工程学报卷℃振摇小时,,,离心测定上清液中的酶活同时将菌体用蜗牛酶和超声波裂解后测定胞内酶活力,结果如表。表显示含。一淀粉酶、糖化酶双基因的转化子的酶活力比含一一,淀粉酶或糖化酶单基因的转化子一及都高而且酶活力基本上分泌到胞外。一表酿酒酵母转化子的酶活力为了进一步确认淀粉酶和习卫,朽糖化酶基因已在酵母中同时表达把的培养上君产“、“】】】】清液用饱和度的一一曰两,甘曰︺材曰自止盐析后上纤维素柱层析进,,⋯⋯行初步纯化用法测酶活分别
8、从上柱流出液及的洗脱液中
