人乙型肝炎病毒聚合酶在酿酒酵母中的表达

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1、人乙型肝炎病毒聚合酶在酿酒酵母中的表达【摘要】目的尝试在酵母中表达人乙型肝炎聚合酶蛋白（HBV-Pol），并用镍基颗粒队蛋白粗提物进行部分纯化。方法将全长HBV-Pol基因用PCR方法扩增并连接到在酿酒酵母高效表达的质粒中。转化株于30℃培养3d后进行诱导表达16h，4℃下收集蛋白粗提物并用镍基颗粒进行提纯。用免疫印迹技术检测表达结果。结果重组的HBV-Pol存在于该型酵母的蛋白粗提物中，该蛋白产物可被Nickel-particle提取。结论本研究为实现HBV-Pol在S.c.中的高水平表达提供了

2、可靠依据，也便于HBV-Pol的生化特性研究以及蛋白纯化和抗体制备的进一步开展。【关键词】乙型肝炎病毒;聚合酶;酿酒酵母Abstract:ObjectiveAttempttoexpressHBV-Polinyeastexpressionsystemandthenpartiallypurifytheroughextractwithnickel-basedparticle.MethodsFulllengthHBV-Polgenewasamplifiedandwasintroducedintoahigh

3、effectiveexpressionplasmidofSaccharomycescerevisiae（S.c.）.Thetransformantwasculturedat30℃for3days,andtheninductionwascarriedoutforanother16hoursat30℃,andtheninductionwascarriedoutforanother16hoursat30℃.Celllysisandpurificationwerepreformedat4℃.Targetp

4、roteinwasdetectedinharvested12roughextractwithwesternblot.ResultsTherecombinantHBV-Polwaspresentinroughextractofyeastandcouldbepurifiedwithnickelparticle.ConclusionsResultsofthisstudyprovethatHBV-PolcanbeexpressedinS.c.yeastandmightfacilitatethebioche

5、micalstudy,proteinpurificationandantibodypreparationofHBV-Pol.Keywords：hepatitisBvirus;polymerase;Saccharomycescerevisiae乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV）感染是全球性公众健康问题。目前世界上约有3.5亿乙肝病毒携带者，其中很大比例将会发展成严重的肝脏疾病例如肝硬化、肝细胞癌及其它综合征［1］。乙肝病毒染色体仅有3200个左右的碱基对，属于hepadnavir

6、idae家族，有极强的肝细胞靶向性［2］。在乙肝病毒生命周期很重要的一步就是它利用自身编码的逆转录酶进行将其染色体复制。乙肝病毒聚合酶蛋白（HBVpolymerase,HBV-Pol）是一种多功能酶，具有蛋白始动活性［3-5］、DNA聚合酶活性、反转录酶活性［6］及RNA酶H活性［7］。它包括了三个结构域，从氨基末端到羰基末端依次是末端蛋白（terminalprotein，TP），聚合酶/逆转录酶（RT）及RNA酶H（RH）。其中末端蛋白与其它两个域间由一空白序列隔开。12尽管HBV-Pol在其生

7、命周期中起到至关重要的作用，但是由于HBV-Pol在异源性表达系统中的表达水平低［8］、可溶状态下极不稳定［9］，协同表达的分子伴侣对该酶的潜在影响［10］等原因，关于该酶的生化研究仍然进展缓慢。Kim等人在协同表达的GRP94的情况下，在大肠杆菌内表达出麦芽糖结合蛋白标记的HBV-Pol，并证明其对乙肝病毒的εRNA有优先结合的特征［11］。Qadri和Siddiqui［6］在酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae，S.C.）表达系统中利用基于Ty1-his3AI逆转座子构建的

8、质粒表达并得到了部分纯化的HBV-Pol，该HBV-Pol在一种病毒类似颗粒中可以将Ty1RNA逆转录为DNA。然而稳定的、不需要分子伴侣协同的大规模地在常用异源性表达系统（如大肠杆菌或酵母）中得到完整的HBV-Pol的方法目前仍未见报道。酵母表达系统在重组蛋白表达研究中得到非常广泛的应用，其中酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae，S.c.）又是最常用的酵母菌株，本研究中，6聚体组氨酸标记的全长HBV-Pol在S.c.中进行表达并用镍基颗粒进行部分纯化。免疫印迹