黑曲霉酸性α-淀粉酶基因和糖化酶基因对工业酒精酵母的整合及其共表达

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1、!!卷!期微生物学报%&’(!!.&(!"##!年$月!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$)*+*,-"##!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!黑曲霉酸性!!淀粉酶基因和糖化酶基因对工业酒精酵母的整合及其共表达""1"1"王海燕秦浚川王敖全唐国敏（1中国科学院微生物研究所微生物资源前期国家重点实验室北京1###$#）（"南京大学医药生物技术国家重点实验室南京"1##60）摘要：用CDE合成的黑曲霉（!"#

2、$%&’(()"*’&$%）酸性!5淀粉酶（)@:F!598>’9,4）的@G.)，构建了由酵母醇脱氢酶（)GH1）启动子和终止子引导表达，酸性!5淀粉酶自身信号肽序列引导分泌的表达元件，与黑曲霉糖化酶@G.)的表达元件同时插入由酵母IG.)序列引导同源整合的酵母JKL型表达载体LMHJ中，构成双基因表达分泌质粒LM)N。采用LM)N与酵母J7L型N!1$抗性表达质粒的共转化，将两个基因表达元件整合到酒精生产酵母菌株)O"P0!/的染色体IG.)序列中，获得同时表达胞外酸性!5淀粉酶和糖化酶的双功能酒精酵

3、母工程菌。关键词：酸性!5淀粉酶，糖化酶，分泌表达，双功能酒精酵母中图分类号：Q$1!文献标识码：)文章编号：###15/"#6（"##!）#!5#!$05#!酵母菌在自然界分布甚广，是发酵工业的重要用于质粒构建，)O"P0!/是酒精生产用工业酵母，本所微生物，主要用于酒精、啤酒和面包工业。酒精在国保存。质粒LRD16用作克隆载体。黑曲霉@G.)文民经济中有着广泛的用途，是化工和制药等的重要库由本实验室构建并保存。LRD165C!561含酵母醇脱原料，又是轻工业中配制各种饮料酒的原料。酒精氢酶（)GH1）

4、启动子；LNS36含)GH"终止子；LMHJ含燃料作为清洁燃料，在环境保护上具有特别重要的酵母IG.)的+1,"57,1H"序列；LTN1含有受酵母磷意义，获得了世界各国越来越大的关注。我国酒精酸甘油激酶（CNT）启动子控制的黑曲霉糖化酶@G.)生产主要使用淀粉质原料。但酒精酵母（+,--.,%/0表达元件；LS7U1/是含有N!1$抗性表达单元的酵母12-$"-$%$3’"’,$）不具有淀粉水解酶的活性不能直接自主复制型质粒，均由本实验室保存。发酵淀粉。原料淀粉需先经过蒸煮、液化、糖化等工"#"#$培养

5、基：VS培养基用于4(-/(’生长和保存。序水解成葡萄糖等可发酵性糖后才能被利用。改良JCG培养基（每升含酵母粉1#+，蛋白胨"#+，葡萄糖菌种，获得能分解和利用淀粉的酵母工程菌，可简化"#+）用于酒精酵母（+,--.,%/12-$"-$%$3’"’,$）的培养；工艺、节省能源和酶制剂、降低成本，有重要的应用含"##的JCG培养基用于酵母转化。添#+W8VN!1$前景。近年来，利用重组G.)技术已将!5淀粉酶基加1X可溶性淀粉的J.S培养基（每升含酵母氮基因和糖化酶基因通过自主复制载体同时引入实验室/PB

6、+，葡萄糖"#+）用于筛选和鉴定分泌表达酸性单倍体酵母，培育出能直接利用淀粉产生酒精的酵!5淀粉酶和糖化酶（N’*@&98>’9,4，N)）的转化子。［1，"］母菌株。本研究将黑曲霉的酸性!5淀粉酶基因"#"#%试剂：N!1$购自北京鼎国生物技术发展中和糖化酶基因整入酒精生产酵母菌株)O"P0!/中，心；CY*G.)C&’>84I9,4为上海O9A+&A生物技术公司旨在获得酒精发酵生产条件下能同时行使各自淀粉产品；各种限制性内切酶及3!G.)V:+9,4为39T9E9水解功能的酒精酵母工程菌，以加快酒精发

7、酵速度生物公司产品；引物由上海生工生物工程技术服务并提高淀粉质原料的利用率和出酒率。公司合成；葡萄糖氧化酶试剂系本所产品。"#$酵母转化"材料和方法参照文献［0］方法进行。"#"材料"#%大肠杆菌转化、质粒提取等分子操作"#"#"菌株和质粒：大肠杆菌（4"-.$%’-.’,-/(’）GH2!参照文献［!］按常规方法进行。基金项目：国家“$/0计划”项目（"##1))"1!121）"通讯作者。34’：$/51#5/"/"606$；7589:’：-+8;9<=>9?&&(@&8(@A作者简介：王海燕（16BB

8、5），女，江苏常州人，硕士研究生，主要从事工业微生物菌种改良研究。收稿日期："##05#65#"，修回日期："##051"5#13>3微生物学报33卷!"#$%&引物设计和扩增反应行鉴定。.+)"酶切应产生:&>JF和>03JF两片段；根据文献［!］发表的!""#$%&酸性!#淀粉酶基/#"A$酶切应产生09>JF和%&!3JF两片段；012%因序列，设计一对引物$%和$&用于从!""#$%&酶切应产生&:0JF、0:9JF和