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1、耐高温酸性α2淀粉酶基因部分序列的克隆与分析1,32221王淑军,邓祥元,李富超,秦松,陆兆新(1.南京农业大学食品科技学院,江苏南京210095;2.中国科学院海洋研究所,山东青岛266071;3.淮海工学院,江苏省海洋生物技术重点建设实验室江苏连云港222005)摘要:利用已报道的α2淀粉酶基因序列的保守区域设计引物,通过聚合酶链式反应(PCR)获得了高温球菌Thermococcussp.HJ21的耐高温酸性α2淀粉酶基因的部分序列。通过对该序列的同源性比较分析发现,高温球菌Thermococcussp.HJ21与热水高温球菌Thermococ2cushydrot
2、hermalis和Thermococcussp.OGL220P的亲缘关系最近,序列相似度达到95%以上;利用SwissModel预测该基因产物的3级结构,显示其具有典型的(β/α)8桶状结构;通过分析密码子的使用情况得知,该α2淀粉酶存在着密码子的兼并性和使用的偏向性问题。关键词:高温球菌;α2淀粉酶;基因克隆;序列分析中图分类号:Q785文献标识码:A文章编号:100023096(2007)1220069207α2淀粉酶,系统名称为α21,42葡聚糖242葡聚糖水本研究利用分离自深海热液喷口的高温球菌为解酶(α21,42glucan242glucanohydrola
3、seEC.3.2.1.1),是研究对象,通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.重要的工业酶制剂之一[1],约占整个酶制剂市场的gov)数据库中报道的已知序列,设计引物,扩增了α225%,已被广泛应用在食品、发酵、纺织、造纸和制药淀粉酶基因的部分序列。该菌的最适生长温度为[2]88℃,属典型的嗜热厌氧菌,而且在其培养液中检测等诸多行业;但现在应用的α2淀粉酶大部分都存在着热稳定性较差和pH范围较窄等方面的缺陷,导到了α2淀粉酶的活性,初步研究发现该α2淀粉酶热致工业生产成本的增加。要使工业生产过程中α2淀稳定性好且具有较好的耐酸性,但由于其难于培
4、养,粉酶的主要特性与生产过程相适应[3],就需要开发故利用PCR的方法获得了α2淀粉酶基因的部分序热稳定性好、活性强、pH适应范围广的α2淀粉酶,为列,并进行了初步分析,以期为在工程菌株中的表达此,众多国内外研究者把目光从陆地投向海洋,尤其起到作用。是深海。1材料与方法α2淀粉酶的来源非常丰富,在动植物及微生物中均发现有该酶的存在,尤其是芽孢杆菌Bacillus属的1.1材料[3]微生物现已被深入地研究和应用,但其最适活力1.1.1菌种与质粒载体温度在60℃左右,远达不到淀粉分解过程中要求的高温球菌Thermococcussp.HJ21和大肠杆菌[4]100～110℃
5、。而大部分嗜热细菌和古菌的最适生(Escherichiacoli)TOP10均由淮海工学院江苏省海长温度在80℃以上,且其中蕴藏了大量的超嗜热酶,洋生物技术重点建设实验室保存;T2A克隆载体而且这些酶对有机变性剂、金属离子等有很好的耐pMD182T为TaKaRa(大连)公司产品。[5]受性,因此,研究开发嗜热菌在工业生产中具有重要的意义。但由于大部分嗜热细菌和古菌较难培养,因此,利用分子生物学和基因工程技术,将α2淀粉酶收稿日期:2007207224;修回日期:2007210210基因克隆转化到基因工程菌株中进行高效表达,获基金项目:中国科学院知识创新工程重要方向项目
6、(KZCX32得所需要的热稳定性高的α2淀粉酶,已成为解决现SW2223,KZCX22YW2209),江苏省“六大人才高峰”第三批资助项目(062A2017);江苏省教育厅自然科学基金项目有α2淀粉酶不足的重要手段和途径。另外,对α2淀(06KJB550004)粉酶基因序列的分析在基因的克隆表达过程中起着作者简介:王淑军(19652),女,山东济南人,硕士,教授,主要重要作用,如密码子使用的偏向性问题等都会影响从事海洋微生物及功能基因的研究,电话:0518285895421,α2淀粉酶基因的表达。E2mail:shujunwang86@hotmail.comMarin
7、eSciences/Vol.31,No.12/2007691.1.2仪器设备与试剂引物合成由Sangon(上海)生物工程技术有限公常/低温台式离心机(Labofuge300/Biofuge司完成,然后以高温球菌Thermococcussp.HJ21基Stratos),美国Thermelectron公司;天平(BP610),德因组为模板,进行目的片段的PCR扩增。国SartoriusÓ公司;PCR仪(Tpersonal),德国Biome2PCR反应体系(20μL),成分组成为:10×buffertra2+Ó公司;电泳仪(PAC300),美国Bio2Ra
