生物柴油基因工程菌的构建及酿酒酵母产油脂条件的研究（可编辑）

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1、生物柴油基因工程菌的构建及酿酒酵母产油脂条件的研究北京化工大学硕士学位论文生物柴油基因工程菌的构建及酿酒酵母产油脂条件研究姓名：杨实权申请学位级别：硕士专业：粮食、油脂及植物蛋白工程指导教师：王芳20100609生物柴油基因工程菌的构建及酿酒酵母产油脂条件研究摘要生物柴油是目前研究的热点，其生产方法是将原料脂肪和甲醇或乙醇在化学催化剂或生物催化剂的催化下，转化合成生物柴油。目前生物柴油的生产最少需要两步：油脂的获得和将油脂转化为生物柴油。如果能将这两步集成在同一个生物体系中，将会大大缩短步骤，提高生

2、物柴油的转化效率。通过构建生物柴油基因工程菌，将生物柴油专用脂肪酶的基因在酵母中表达，有可能直接把酵母合成的油脂和乙醇在重组体系产生的脂肪酶催化下合成脂肪酸乙酯，从而获得一种高效的生物柴油生产新技术。本文克隆了假丝酵母脂肪酶的成熟肽基因Lip2，同时克隆了酿酒酵母的强启动子PGKl和终止子CYCl，构建了两个重组表达载体cerevsiae中进行胞内表达；同时，本文利用响应面法对酿酒酵母产油脂条件进行了优化。本文对此设想进行了如下主要工作：1、以假丝酵母Candidasp．99．125基因组为模板PC

3、R扩增得到大性转化子进行验证及序列测定，测定结果与报道完全一致；Z；／p2基因片段经过双酶切处理后插入至IJpYES2质粒中，成功构建了重组表达载体在胞内有表达，而在胞外基本没有表达。但是酶活检测结果表明，胞内目的蛋白基本上没有活性。2、以酿酒酵母Saccharomyces筛选阳性转化子进行验证及序列测定，测定结果与报道完全一致；通过重基因和融合基因插入到YEp352质粒中，成功构建了重组表达载体北京化工大学硕士学位论文外基本没有表达。酶活检测结果表明，胞内目的蛋白具有1．3U／mL左右的酶活。3、

4、运用响应面法对酿酒酵母Saccharomycescerevisiae产油脂以及发设计对影响其产油脂相关因素进行评估并筛选出具有显著效应的3个因素：柠檬酸，CaCl2和初始pH值。接着用最陡爬坡试验逼近以上3个因子的最大响应区域后，采用Box-Behnken设计以及响应面分析法，确定其优化后发酵条件为w／v：葡萄糖15％，蛋白胨0．2％，酵母浸粉0．4％，柠檬酸0．1％，ZnS04??7H200．2％，CaCl20．471％，MgS04??7I-120r／min，30℃培养96h。优化后的油脂产率干0

5、．005％，初始pH值为6．74，180重达至1]14．55％，比在种子培养基中油脂产率4．76％提高了2倍左右。关键词：生物柴油，酿酒酵母，脂肪酶，响应面，油脂。nofConstructionREcombinantStrainsofCapableProducingBiodieselandResearchAboutProductionConditionsofLipidABSTRACTThehotbiodieseliSaresearchmethodiSthattherawspot，itsproduct

6、ionmaterialfatandtheaLCoholortheaLCoholmethylethylcatalysisedbyoraletransformedtobiodiesel．Atchemistrycatalystbiocatalystpresent，thebiodiesel’Sneedstotwofatandtransferthefatproductionsteps：Howacquiretothebiodiesel．IfCanthesetwointheidenticalintegratest

7、epsbiologicalwillreducetheandcallenhancethethetransformsystem,itgreatlystepsofbiodiesel．efficiencyconstructionofrecombinantstrainsofThroughcapableproducingtowantinthebiodiesel，weexpressspecial-purposelipase'sgeneyeast．Thisandacidesterthemaypossibilityd

8、irectlycatalysissynthesizefattyethylusingfatandtheaLCoholthatthewhichethylyeastsynthesiscatalysisedbylipaseafteristhetOproducedreorganizationsystemtransforms．Finally，wehopeobtainoneneweffectivetothebiodiesel．highlytechnologywayproduceIn