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《人Cu%2CZn-SOD大肠杆菌与酿酒酵母工程菌的构建和发酵条件的优化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、分类号：单位代码：研究生学号：密级：公开吉林大学硕士学位论文（学术学位）人Cu,Zn-SOD大肠杆菌与酿酒酵母工程菌的构建和发酵条件的优化ConstructionofHumanCu,Zn-SODEngineeringStrainsofEscherichiacoliandSaccharomycescerevisiaeandOptimizationofFermentationConditions作者姓名：专业：发酵工程研究方向：生物活性成分代谢优化与控制指导教师：培养单位：2018年月人Cu,Zn-SO
2、D大肠杆菌与酿酒酵母工程菌的构建和发酵条件的优化ConstructionofHumanCu,Zn-SODEngineeringStrainsofEscherichiacoliandSaccharomycescerevisiaeandOptimizationofFermentationConditions作者姓名：张晓佳专业名称：发酵工程指导教师：赵寿经教授学位类别：工学硕士答辩日期：2018年5月31日未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的
3、全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：2018年5月摘要摘要通过基因工
4、程技术生产人Cu,Zn-SOD具有产量高，活性稳定，纯度高的优点，且避免了Cu,Zn-SOD异源蛋白排斥的免疫性过敏反应，解决了从血液中提取Cu,Zn-SOD的排异问题。对Cu,Zn-SOD的工业生产和在医疗、生化品及食品中的应用具有重大的意义。本研究旨在利用基因工程的方法，构建人Cu,Zn-SOD的原核表达工程菌和真核表达工程菌，分别优化其发酵条件以提高表达量和酶活性，并对两种表达工程菌进行比对和分析，以利于后续的研究和生产。本研究根据大肠杆菌密码子偏好性对人Cu,Zn-SOD的核苷酸序列改造并人
5、工合成，将其与质粒pET-22b（+）结合构建表达载体，转化入大肠杆菌BL21（DE3）中，以IPTG诱导实现分泌表达，并进一步对其发酵条件进行优化以提高表达量和蛋白活性。根据酿酒酵母密码子偏好性对人Cu,Zn-SOD的核苷酸序列改造并人工合成，将其与质粒pAUR123结合构建表达载体，转化入酿酒酵母中，并进一步对其发酵条件进行优化以提高表达量和蛋白活性。通过运用工程菌的优势密码子对外源目的基因进行改造，提高工程菌异源表达量，充分发挥各自的优势，挖掘大肠杆菌和酿酒酵母作为异源表达工程菌的生产潜力，为
6、后续研究和工业化生产奠定基础。本研究的主要内容如下：（1）根据大肠杆菌密码子偏好性对人Cu,Zn-SOD的核苷酸序列改造，结合质粒信息在序列两端加入限制性内切酶EcoRⅠ与HindⅢ酶切位点，并人工合成目的基因序列Cu,Zn-SOD-E.coli，通过双酶切与T4连接酶作用将Cu,Zn-SOD-E.coli与质粒pET-22b（+）连接构建表达载体pET-22b-SOD，转化进大肠杆菌BL21（DE3）中，构建人Cu,Zn-SOD大肠杆菌工程菌BL21-22b-SOD。（2）培养大肠杆菌工程菌BL2
7、1-22b-SOD，IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE、Bradford法检测工程菌目的蛋白表达情况，结果表明工程菌BL21-22b-SOD表达的目的条带分子量约为16kDa，总蛋白浓度是19.91mg/mL，目的蛋白占总蛋白比例约为17.6%，目的蛋白浓度为3.50mg/mL。通过邻苯三酚自氧化法测定粗酶液活性，测得粗酶液活性为977.2U/mL，计算得酶比活为279.2U/mg。（3）根据酿酒酵母密码子偏好性对人Cu,Zn-SOD的核苷酸序列改造，结合质粒信息在序列两端加入限制性内切酶Sma
8、Ⅰ与SacⅠ酶切位点，并人工合成目I吉林大学硕士学位论文的基因序列Cu,Zn-SOD-Yeast，通过双酶切与T4连接酶作用将Cu,Zn-SOD-Yeast与质粒pAUR123连接构建表达载体pAUR123-SOD，转化进酿酒酵母中，构建人Cu,Zn-SOD酿酒酵母工程菌Yeast-123-SOD。（4）培养酿酒酵母工程菌Yeast-123-SOD表达，通过SDS-PAGE、Bradford法检测工程菌目的蛋白表达情况，结果表明工程菌Yeast-123-SOD表达的目
