酿酒酵母代谢工程菌的构及代谢工程研

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1、1木糖还原酶编码序列（XYL1F）的克隆转化1.1ATCC58785树干毕赤酵母基因组的提取1.1.1菌体干粉的制备123图1ATCC58785基因组提取结果将培养20h的树干毕赤酵母于4500rpm离心10min后收集菌体沉淀，真空干燥，500ml发酵液约得到1.3g干燥菌粉。1.1.2基因组的提取采用OMEGAFungalDNAMiniKit进行基因组提取。1.1.3电泳检测1：λ-HindⅢdigest（3.5uL）2：21mg菌粉提取的基因组（5uL）3：31mg菌粉提取得基因组（5uL）1.2XYL1基因的PCR扩增1.2.1第一次PCR（1）反

2、应体系TemplateDNA2.0ul10×buffer5.0ulMgCl2（25mmol/L）6.0ulX1-primer1（25umol/L）1.0ulX1-primer2（25umol/L）1.0uldNTP（2mmol/L）4.0ulTaq酶（5u/L）1.0ul灭菌超纯水补齐至50ul（2）PCR扩增程序为：94℃4min94℃30S61℃30S20个循环72℃60S72℃10min4℃保存12345End（3）电泳检测1：100bpDNAladder（3.5uL）2：100bpDNAladder（3.5uL）3：21mg菌粉提取得基因组作为模版

3、（5uL）4：31mg菌粉提取得基因组作为模版（5uL）5：31mg菌粉提取的基因组作为模版（5uL）PCR扩增失败。1.2.2Tm值的摸索（1）反应体系图2XYL1基因的PCR扩增结果TemplateDNA1.0ul10×buffer2.0ulMgCl2（25mmol/L）1.5ulX1-primer1（25umol/L）0.5ulX1-primer2（25umol/L）0.5uldNTP（2mmol/L）2.0ulTaq酶（5u/L）0.5ul灭菌超纯水补齐至20ul（2）PCR扩增程序为：94℃4min94℃30S52～62℃50S30个循环72℃9

4、0S72℃10min4℃保存End165432165432图3XYL1PCR中Tm摸索结果（3）电泳检测上1：100bpDNAladder（1.5uL）上2：PCRTm为52.3℃（10ul）上3：PCRTm为53.7℃（10ul）上4：PCRTm为54.8℃（10ul）上5：PCRTm为53.7℃（10ul）上6：PCRTm为52.3℃（10ul）下1：100bpDNAladder（1.5uL）下2：PCRTm为56.3℃（10ul）下3：PCRTm为58.0℃（10ul）下4：PCRTm为59.4℃（10ul）下5：PCRTm为61.3℃（10ul）下

5、6：PCRTm为62.0℃（10ul）所以选52.3℃为XYL1PCR扩增时的退火温度。1.2.3XYL1的PCR扩增（1）反应体系①反应体系1TemplateDNA2.5ul10×buffer5.0ulMgCl2（25mmol/L）3.75ulX1-primer1（25umol/L）1.25ulX1-primer2（25umol/L）1.25uldNTP（2mmol/L）5.0ulTaq酶（5u/L）1.2ul灭菌超纯水补齐至50ul②反应体系2TemplateDNA2.5ul10×buffer5.0ulMgCl2（25mmol/L）3.75ulX1-p

6、rimer1（25umol/L）0.5ulX1-primer2（25umol/L）0.5uldNTP（2mmol/L）5.0ulTaq酶（5u/L）1.25ul灭菌超纯水补齐至50ul③反应体系3TemplateDNA2.0ul10×buffer5.0ulMgCl2（25mmol/L）6.0ulX1-primer1（25umol/L）1.0ulX1-primer2（25umol/L）1.0uldNTP（2mmol/L）4.0ulTaq酶（5u/L）1.0ul灭菌超纯水补齐至50ul（2）PCR扩增程序为：94℃4min94℃30S52.3℃50S30个循环

7、72℃90S1234图4XYL1的PCR扩增结果72℃10min4℃保存End（3）电泳检测1：100bpDNAladder（2.5uL）2：反应体系3（25ul）3：反应体系3（25ul）4：反应体系3（25ul）反应体系1的扩增结果较好。1.3XYL1基因的凝胶回收1.3.1凝胶回收本次胶回收采用上海生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒进行1.123图5XYL1的胶回收结果3.2电泳检测1：100bpDNAladder（2.5uL）2：胶回收后的XYL1（5ul）3：T质粒片段（5ng/ul，5ul）1.4XYL1与T质粒连接和转化反应体系15ul

8、实验组阳性对照因性对照2×RapidLigationBuffer7