木聚糖乙醇代谢工程酿酒酵母菌的构建

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1、暨南大学博士学位论文木聚糖乙醇代谢工程酿酒酵母菌的构建ConstructionofthexylanethanolmetabolismengineeredstrainofSaccharomycescerevisiae作者姓名：熊春江指导教师姓名：刘泽寰博士研究员及学位、职称：学科、专业名称：生物化学与分子生物学论文提交日期：二〇一五年四月论文答辩日期：二〇一五年六月答辩委员会主席：论文评阅人：学位授予单位和日期独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和

2、致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得暨南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解暨南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权暨南大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学

3、位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话：通讯地址：邮编：暨南大学博士学位论文中文摘要酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）是公认安全（GenerallyRecognizedasSafe,GRAS）的菌株。由于其缺乏代谢木糖产生木酮糖的关键酶，因此不能利用木糖进行生长和发酵。为了充分利用半纤维素发酵生产乙醇，同时降低木聚糖乙醇的生产成本，本论文通过基因工程对二倍体工业酿酒酵母AS2.489进行了代谢途径的改造，以期获得

4、能进行统合生物工艺发酵木聚糖产乙醇的重组菌。本论文通过构游离表达载体，将木聚糖酶基因xyn2、木糖苷酶基因xlnD、栖瘤胃真菌木糖异构酶基因xylA和木酮糖激酶基因xks1同时导入到酿酒酵母中，分别构建了木糖代谢重组酿酒酵母（AS-KA）和利用统合生物工艺发酵木聚糖产乙醇的重组酿酒酵母AS-KAXD。通过酶活性分析，筛选出酶活性较高的菌株AS-KA1和AS-KAXD-1。对AS-KA1和AEAS-KAXD1进行木糖生长的适应性进化（adaptiveevolution），获得进化菌株AS-KA-27BAE和AS-KAXD-1

5、4。在微氧下发酵木糖，两种菌株的最高乙醇产量分别为5.752g/L和4.485g/L，木糖乙醇转化率分别达到理论值的69.3%和63.7%。木聚糖同步糖化发酵时，添加木聚糖酶（CAS:9025-57-24）酶量为5U/g底物时，AEAEAS-KA-27B和AS-KAXD-14分别产乙醇3.025g/L和2.809g/L，木聚糖到乙醇的转化率分别为理论值的26.0%和24.1%。AE统合生物工艺发酵木聚糖结果显示，进化菌株AS-KAXD-14和重组菌株AS-KAXD-1的乙醇产量分别为0.544g/L和0.433g/L，木聚

6、糖到乙醇的转化率分别为理论值的4.6%和3.8%。关键词：酿酒酵母；木聚糖；乙醇；同步糖化发酵；统合生物工艺I暨南大学博士学位论文AbstractSaccharomycescerevisiaeisamicroorganismthatgenerallyrecognizedassafe(GRAS).Itcannotgrownorfermentonxylose,becauseoflackingtheenzymestoconversexyloseintoxylulose.Tomakefulluseofhemicellulosean

7、dtoreducethecostofxylanethanol,thispapermodifiedthemetabolicpathwayoftheindustrialdiploidS.cerevisiae.AS2.489throughgeneticengineeringandobtainedtherecombinantstrainswhichcanfermentxylanbyconsolidatedbioprocessing.Inthispaper,thexyn2,xlnD,xylAandxks1genewereintrod

8、ucedintoS.cerevisiaebyepiscopalexpressionvectorscarryingthereplicationoriginsiteofthe2-micrometreplasmid.ArecombinantS.cerevisiaeAS-KAwhichcanfermentxyl