海洋来源产木聚糖酶的链霉菌菌种筛选与代谢工程改造

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1、硕士学位论文海洋来源产木聚糖酶的链霉菌菌种筛选与代谢工程改造ScreeningandMetabolicEngineeringofMarine--derivedStreptomycesStrainswithImprovedXylanaseProduction学号：21018011完成日期：窒Q!呈生．墨旦垒旦大连理工大学DalianUniversityofTechnology大连理工大学学位论文独创性声明作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和

2、致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。学位论文题目：渔注塞塑芒丕鬈擅鳖鲍垡茎菌董狴篮垫塑垡邋王猩这造作者签名：皇尘曼日期：塑当年—L月j旦日大连理工大学硕士学位论文摘要玉米秸秆、小麦秸秆等农业废弃物是来源丰富的可再生生物质资源，利用其进行可再生清洁能源和生物基化学品的生产日益引起人们的关注。农用废弃物的主要成分是纤维素和半纤维素，其

3、中半纤维素占地球可再生有机碳源的三分之一，而木聚糖是半纤维素的主要成分。木聚糖的降解不仅能够被微生物利用转化，而且有助于纤维素与木质素的分离，在生物燃料生产和纸浆漂白等领域有重要的应用。木聚糖酶降解木聚糖以其环境友好和高效性成为木聚糖的主要降解方式。放线菌和丝状真菌是木聚糖酶的主要生产菌，但是野生型菌株中木聚糖酶的产量通常很低。因此如何提高木聚糖酶的生产水平，成为微生物育种中的关键问题。本文首先从大连黄海海域的小平岛海泥样品中分离获得了八株木聚糖酶活性较好的海洋放线菌菌株，其中菌株M8和M11具有较高的木聚糖酶活

4、性。16SrRNA分析结果表明，菌株M8的16SrRNA序列与蚀木链霉菌(Streptomycesxylophagus)的序列相似性达到100％；M11的16SrRNA序列与绿色产色链霉菌(Sviridochromogenes)的序列相似性达到99％。考察不同pH条件下菌株的生长发现，M1l是一株嗜碱链霉菌，在pH11．0的高碱环境中生长良好；而菌株M8具有较好的NaCl耐受性。两株菌株均具有较高的木聚糖酶活性，培养7天后酶活性分别达到87．6U／mL和69．9U／mL。酶学性质结果表明，M8木聚糖酶的最适温度为

5、60℃，最适pH为6．0；M1l木聚糖酶的最适温度为70℃，最适pn为6．0。其中，M11木聚糖酶在60℃或pH5．0．9．0等极端环境中表现出较好的稳定性，且无纤维素酶活性，证明该木聚糖酶有望在纸浆漂白工艺中进行应用。其次，利用核糖体工程和人工锌指蛋白技术在细胞全局水平上对海洋链霉菌的木聚糖酶合成水平进行调控。本文从370株链霉素抗性菌株中筛选获得了27株透明圈较大的突变体。进一步的液体酶活测试结果表明，突变菌株M11．1(10)的木聚糖酶产量与野生型相比提高了14％。对其核糖体S12蛋白基因(rpsL)进行扩

6、增和测序，发现存在一个突变位点K88R。该位点位于$12蛋白的核心催化区域中，与70S核糖体复合物的稳定性及翻译效率紧密相关，推测该位点可能是突变株酶蛋白合成水平提高的原因。在酵母菌锌指蛋白文库基础上构建了以锌指结构域为DNA结合域，Gal4为激活功能域的放线菌人工锌指蛋白文库。筛选获得了高产木聚糖酶的突变体M8．B32，其木聚糖酶产量与野生型相比提高了17％。对锌指蛋白的氨基酸序列进行分析，结果表明，整合至菌株M8一B32基因组中的锌指蛋白基因来源于人类基因组，推测该锌指转录因子能够与木聚糖酶合成相关基因的启动

7、子上游区域结合，调控木聚糖酶的产量。海洋来源产木聚糖酶的链霉菌菌种筛选与代谢工程改造本文的研究结果证明了核糖体工程技术和人工锌指蛋白技术在放线菌菌种改造中应用的可行性。目前对放线菌木聚糖酶合成调控的研究较少，本文的研究为进一步通过代谢工程改造海洋酶蛋白的生产奠定了基础。关键词：海洋链霉菌；木聚糖酶；核糖体工程；人工锌指蛋白技术大连理工大学硕士学位论文ScreeningandMetabolicEngineeringofMarine—derivedStreptomycesStrainswithImprovedXyla

8、naseProductionAbstractAgriculturalresiduessuchascomstoverandwheatstrawareabundantandrenewablebioresources，andtheutilizationoftheseresidueshasarousedtheworldwideconcernofresearchers．Hemice