异源合成左旋海松酸的酿酒酵母菌株构建

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1、异源合成左旋海松酸的酿酒酵母菌株构建Saccharomycescerevisiaeconstructionforheterologoussynthesisoflevopimaricacid学科专业：生物化工作者姓名：刘婷指导教师：卢文玉副教授天津大学化工学院二零一七年五月独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研

2、究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日摘要左旋海松酸是松柏类树木中很重要的一种松香树脂酸，可以帮助松柏类树木防御

3、昆虫和病毒。左旋海松酸也是重要的工业中间体物质，它的Diels-Alder反应产物可以广泛地应用于涂料、印刷、增塑剂、粘合剂等方面。有的左旋海松酸衍生物具有抗炎症、抗氧化、治疗心血管疾病等功能。本文将合成左旋海松酸的外源途径导入酿酒酵母中，并对合成途径进行了优化，提高了左旋海松酸的产量。首先，构建了左旋海松二烯合酶的表达质粒PXP320-LPS，将表达质粒转化到菌株WTI-BE中，生成左旋海松二烯，然后对LPS酶进行蛋白改造，设计了T40，T60，T79三种N端截短方式，并对LPS进行了特异性位点突变，研究结果表明T7

4、9ΔLPS型的左旋海松二烯产量最高（6.9mg/L），是原始LPS（0.3mg/L）的23倍。其次完成了T79ΔLPS与酵母内源GGPP合酶—Bts1的融合实验，WTI-BE-(Bts1-linker4-T79ΔLPS)单拷贝的左旋海松二烯产量最高，达到10.2mg/L。构建了更适于生产左旋海松二烯的底盘菌株WTE-9，在WTE-9中过表达Bts1和T79ΔLPS，使左旋海松二烯产量达到49.2mg/L。然后，进行了CYP720B1酶与CPR的适配性实验，研究结果证实拟南芥AtCPR1、东北红豆杉TcCPR均可以与CY

5、P720B1适配，催化左旋海松二烯生成左旋海松酸，且TcCPR与CYP720B1的适配性更好。最后，在菌株WTE-9-Bts1-T79ΔLPS多拷贝中过表达CYP720B1和TcCPR，得到的WTE-9-Bts1-T79ΔLPS多拷贝-CYP720B1多拷贝-TcR多拷贝左旋海松酸产量为45.2mg/L，通过摇瓶补料发酵，挡板摇瓶实验，使得左旋海松酸产量提高到109.5mg/L。关键词：酿酒酵母，左旋海松酸，合成生物学IABSTRACTLevopimaricacid,animportantditerpeneresina

6、cidinconiferscanhelpdefenseagainstinsectsandpathogens.Levopimaricacidisalsoasignificantindustrialintermediate,andit’sDiels-Alderreactionproductsarewidelyusedforcoatings,printinginks,plasticizersandadhesives.Somelevopimaricacidderivativesshowanti-inflammatry,card

7、iovascularandantioxidanthighvalue-addedactivities.Inthisstudy,heterologouspathwayofLevopimaricacidbiosynthesiswasintroducedintoSaccharomycescerevisiae,andwithoptimizing,theproductionofLevopimaricacidincreased.Firstly,expressionvectorwithlevopimaradienesynthasewa

8、sconstructedandtransformedintostrainWTI-BE,andlevopimaradienewasdetected.ThenmodificationsofLPSproteinweretaken,includingtruncatingN-terminal40aa,60aa,79aaandsite-dir