辅酶合成对酿酒酵母异丁醇产量的影响

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1、分类号：密级：UDC：编号：河北工业大学硕士学位论文辅酶合成对酿酒酵母异丁醇产量的影响论文作者：李敬知学生类别：全日制专业学位类别：工学领域名称：生物工程指导教师：姜艳军职称：教授张爱利副教授张盈盈高工2017年5月资助基金项目：国家自然科学基金(21206028)；教育部博士点基金新教师类(20121317120014)；河北省自然科学基金(B2013202288)；河北省教育厅高等学校科学技术研究项目(q2012024)；河北工业大学优秀青年科技创新基金项目(2012009)。DissertationSubmittedtoHebeiUnivers

2、ityofTechnologyForTheMasterDegreeofBiologicalEngineeringEFFECTOFCOFACTORBIOSYNTHESISONISOBUTANOLYIELDINSaccharomycescerevisiaeByLijingzhiSupervisor:Prof.JiangYanjunAssociateProf.ZhangAiliSeniorEngineerZhangyingyingMay2017ThisstudywasfundedbytheNationalNaturalScienceFoundationof

3、China(grantnumber21206028),co-fundedbytheDoctoralFundofMinistryofEducation(grantnumber20121317120014),theHebeiProvinceNaturalScienceFund(grantnumberB2013202288),theHebeiProvincialOfficeofEducationScienceandTechnologyResearchProjects(grantnumberq2012024),andtheOutstandingYouthSc

4、ienceandTechnologyInnovationFundofHebeiUniversityofTechnology(grantnumber2012009).摘要随着化石能源的逐渐枯竭，生物质能源正在日益受到学术界的重视。与第一代生物质能源生物乙醇相比，异丁醇具有挥发性小、吸湿性低、热值高、辛烷值高等特点。可以作为乙醇的替代品，与汽油按一定比例混合以提高燃料性能。现阶段，多数微生物自身不能生产异丁醇且对异丁醇有较低的耐受性，异丁醇产量很难提高。酿酒酵母因其自身含有异丁醇代谢通路且对醇类有较高的耐受性受到了学术界和工业界的关注。而且，酿酒酵母作为

5、真核生物中的模式生物，全基因测序已经完成，有较为成熟的DNA改造技术。因此，本课题选用酿酒酵母作为受试菌株，利用生物法合成异丁醇，并应用DNA重组技术提高酿酒酵母异丁醇产量。本工作以实验室保藏的酿酒酵母W303-1A为出发菌株，通过对酿酒酵母生物合成异丁醇代谢途径进行分析，利用DNA重组技术，构建异丁醇产量较高的酿酒酵母菌株。在实验室前期工作的基础上，本工作的主要工作包括以下四方面：第一，构建过量表达编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的ZWF1基因的质粒YCplac22-ZWF1，提升NADPH的合成量以维持酿酒酵母细胞内NADP+/NADPH平衡。将质粒Y

6、Cplac22-ZWF1转化入实验室前期构建的工程菌种，得到过量表达ZWF1的工程菌，并对菌株的发酵性能进行了研究。第二，构建过量表达编码乙酰乳酸还原异构酶的ILV5基因的质粒YEplac112-PGK1p-ILV5-GFP-CYC1。将质粒YEplac112-PGK1p-ILV5-GFP-CYC1转化入同时过量表达ILV2、ARO10和BAT2的工程菌中，检测菌株的发酵性能，研究ILV5对异丁醇产量的影响。第三，构建过量表达编码依赖NADPH的乙醇脱氢酶的ADH7基因的质粒YCplac33-TDH3p-COX4-ADH7-GFP-CYC1；在二倍体

7、酿酒酵母中同时过量表达BAT2、ILV2、ILV3、ILV5、ARO10，ADH7、ZWF1等基因，并研究工程菌的发酵性能。第四，利用突变剂甲基磺酸乙酯（EMS）对酿酒酵母进行随机突变，筛选对异丁醇具有较高耐受性的W303-1A酿酒酵母菌株。本工作构建了20株工程菌（参见表2.3），并对这20株工程菌的发酵性能进行了研究，检测了不同发酵时间下菌株的生长情况、耗糖情况、异丁醇和乙醇的合成情况。研究结果表明，工程菌HZAL-7pILV2pLV322-ZWF1比对照菌株异丁醇产量提高4.7倍。这说明通过适量过表达ZWF1基因，可以为细胞提供合成异丁醇所必需

8、的还原力NADPH，有效地维持酿酒酵母细胞内辅酶的平衡，有利于异丁醇产量的提高。同时，本工作的研究结果也表明